透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法
Summary
透明ゼブラフィッシュ胚の卵黄への異種移植のプロトコルについて、シンプルで迅速な病期分類法によって最適化されています。注射後の解析には、生存率と、フローサイトメトリーによる異種移植細胞の疾患負荷の評価が含まれます。
Abstract
腫瘍の挙動に関するin vivo研究は、がん研究の定番です。しかし、マウスの使用には、コストと時間の面で大きな課題があります。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生を移植モデルとして紹介しますが、これはマウスモデルに比べて取り扱いの容易さ、低コスト、実験期間の短縮など、多くの利点があります。さらに、幼虫期には適応免疫系がないため、免疫不全株を作製して使用する必要がなくなります。ゼブラフィッシュの胚における異種移植のための確立されたプロトコルが存在しますが、ここでは、より迅速な移植のための胚の病期分類、生存分析、および疾患負荷を評価するためのフローサイトメトリーの使用を含む改善された方法を紹介します。胚は、幼虫の卵黄への迅速な細胞注入と、注入された細胞ボーラスの一貫性を監視するための細胞マーキングを容易にするためにステージングされます。注射後、胚生存分析は注射後7日まで評価されます(dpi)。最後に、転写された細胞を蛍光タンパク質で標識し、フローサイトメトリーで解析することにより、疾患負荷も評価されます。フローサイトメトリーは、ゼブラフィッシュの胚から細胞懸濁液を調製する標準化された方法によって可能になり、ゼブラフィッシュ細胞の初代培養の確立にも使用できる可能性があります。要約すると、ここで説明する手順により、研究群あたりの動物数が多いin vivoでの腫瘍細胞の挙動をより迅速に、より費用対効果の高い方法で評価できます。
Introduction
in vivoでの遺伝子改変または薬物治療に応答した腫瘍の挙動の解析は、がん研究の重要な要素である1,2,3,4。このような研究は、ほとんどの場合、免疫不全マウス(Mus musculus)モデルの使用を伴います5。しかし、マウスでの異種移植研究は、限られた容量、長期にわたる期間、多額の費用、および内部腫瘍の進行を監視するための高度な画像装置の必要性など、多くの点で制限されています6,7。対照的に、ゼブラフィッシュモデル(Danio rerio)は、より大きな容量、より短い期間、より低い費用を可能にし、そしてその透明性により、疾患の進行を簡単に監視することができます8,9。
ゼブラフィッシュは、子宮外で発生し、繁殖力が高い、よく発達した脊椎動物モデルシステムであり、個々のメスは100個以上の胚を産生します10。また、ゼブラフィッシュの胚は透明であるため、レポーターなどの蛍光関連技術を用いて発生過程を容易に可視化することができます。最後に、重要な発生過程の保存は、移植された悪性細胞の挙動を含む多くの種類の研究にとって理想的なモデルとなる11,12。野生型のゼブラフィッシュの胚はメラノサイトを発達させ、生後2週間までに光学的に不透明になりますが、これはキャスパーの胚(roya9;MITFAW2)は、生涯を通じて透明なままです13。その光学特性により、キャスパーゼブラフィッシュは移植された腫瘍細胞14,15,16の理想的なレシピエントです。ゼブラフィッシュへの腫瘍細胞の異種移植は、過去20年間で重要性を増しています17,18,19,20,21。ゼブラフィッシュの胚は自然免疫を持っています。しかし、幼虫期には適応免疫がないため、機能的に免疫不全になり、移植された腫瘍異種移植片の効果的な宿主として機能することができます22。
ゼブラフィッシュの胚だけでなく、多くの異なる変数23,24,25,26,27を考慮した成体における腫瘍生着のためのプロトコルが開発されています。これらは、卵黄、ビテリン周囲腔、心臓、およびさまざまな発生段階におけるゼブラフィッシュの腫瘍沈着の多数の部位を調査してきました16,28。ゼブラフィッシュのゼノグラフトの水産養殖の周囲温度も重要で、ゼブラフィッシュの飼育は通常28°Cで行われ、哺乳類の細胞は37°Cで増殖します。 したがって、魚が許容しながら腫瘍の成長をサポートする妥協的な温度を採用する必要があり、34°Cは両方の目標を達成するように見えます29。異種移植後の腫瘍の挙動と進行の分析は、もう一つの主要な焦点領域であり、これには、生存分析30だけでなく、さまざまな画像診断法の使用が含まれます。ゼブラフィッシュモデルの主な利点の1つは、腫瘍の挙動に関するin vivo研究に計り知れない統計的検出力を提供するために、多数の研究動物を利用できることです。しかし、以前のアプローチでは、注射のための面倒な取り付け手順が必要なため、この可能性は大幅に制限されていました。
ここでは、透明な キャスパー ゼブラフィッシュ系統を使用して、高スループットと注入品質のモニタリングを可能にする、胚をステージングするためのシンプルで迅速な方法を開発することで、この制限に対処します。これは、受精後2日(dpf)に キャスパー ゼブラフィッシュ胚の卵黄嚢に異種移植片を注入することを伴う。異種移植後の胚の生存を腫瘍挙動解析の一環として観察します。さらに、異種移植後の疾患負荷の評価を、シングルセル懸濁液を作製し、フローサイトメトリーで解析する方法を示します(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュの異種移植は、マウス研究に代わる迅速で堅牢で費用対効果の高い方法として浮上しています12。ゼブラフィッシュの異種移植にはいくつかのアプローチが報告されていますが、私たちの適応は大幅な改善をもたらしました。これらの改善は、手技に関するパラメータを標準化することに加えて、腫瘍注射の実施速度を加速することに特に焦点を当ててい?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIHの助成金R37AI110985とP30CA006927、ペンシルベニア州、白血病リンパ腫協会、およびビショップ基金からの予算によって支援されました。この研究は、Fox Chaseの中核施設であるCell Culture、Flow Cytometry、Laboratory Animal施設からも支援を受けました。FCCCのゼブラフィッシュとマイクロインジェクション施設を維持してくださったJennifer Rhodes博士に感謝します。
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
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