Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra
Summary
Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.
Abstract
Estudos in vivo do comportamento do tumor são um elemento básico da pesquisa do câncer; no entanto, o uso de camundongos apresenta desafios significativos em custo e tempo. Aqui, apresentamos o peixe-zebra larval como um modelo de transplante que apresenta inúmeras vantagens sobre os modelos murinos, incluindo facilidade de manuseio, baixo custo e curta duração experimental. Além disso, a ausência de um sistema imunológico adaptativo durante os estágios larvais evita a necessidade de gerar e usar cepas imunodeficientes. Embora existam protocolos estabelecidos para xenotransplante em embriões de peixe-zebra, apresentamos aqui um método aprimorado envolvendo o estadiamento embrionário para transferência mais rápida, análise de sobrevivência e o uso de citometria de fluxo para avaliar a carga da doença. Os embriões são preparados para facilitar a injeção rápida de células na gema das larvas e a marcação celular para monitorar a consistência do bolo celular injetado. Após a injeção, a análise de sobrevivência do embrião é avaliada até 7 dias após a injeção (dpi). Finalmente, a carga da doença também é avaliada marcando as células transferidas com uma proteína fluorescente e análise por citometria de fluxo. A citometria de fluxo é possibilitada por um método padronizado de preparação de suspensões celulares de embriões de peixe-zebra, que também pode ser usado no estabelecimento da cultura primária de células de peixe-zebra. Em resumo, o procedimento descrito aqui permite uma avaliação mais rápida do comportamento das células tumorais in vivo com maior número de animais por braço de estudo e de maneira mais econômica.
Introduction
A análise do comportamento dos tumores em resposta à alteração genética ou ao tratamento medicamentoso in vivo é um elemento essencial da pesquisa do câncer 1,2,3,4. Tais estudos geralmente envolvem o uso de modelos de camundongos imunocomprometidos (Mus musculus)5; No entanto, os estudos de xenotransplante em camundongos são limitados em muitos aspectos, incluindo capacidade limitada, duração prolongada, despesas significativas e a necessidade de equipamentos de imagem sofisticados para monitorar a progressão de tumores internos 6,7. Por outro lado, o modelo zebrafish (Danio rerio) permite maior capacidade, menor duração, menor gasto e, devido à sua transparência, monitoramento simples da progressão da doença 8,9.
O peixe-zebra é um sistema modelo de vertebrado bem desenvolvido com desenvolvimento ex-útero e alta fecundidade, com fêmeas individuais produzindo mais de 100 embriões10. Além disso, os embriões de peixe-zebra são transparentes, permitindo fácil visualização dos processos de desenvolvimento usando técnicas relacionadas à fluorescência, como repórteres. Finalmente, a conservação de processos críticos de desenvolvimento os torna um modelo ideal para muitos tipos de estudos, incluindo o comportamento de células malignas transplantadas 11,12. Os embriões de peixe-zebra do tipo selvagem desenvolvem melanócitos, que os tornam opticamente opacos às 2 semanas de idade, mas isso foi superado pela geração de embriões de casper (roya9; mitfaw2), que permanecem transparentes ao longo da vida13. Devido às suas propriedades ópticas, o peixe-zebra casper é um receptor ideal de células tumorais transplantadas 14,15,16. O xenotransplante de células tumorais em peixe-zebra ganhou importância nas últimas 2 décadas 17,18,19,20,21. Os embriões de peixe-zebra têm imunidade inata; no entanto, eles carecem de imunidade adaptativa durante o estágio larval, tornando-os funcionalmente imunocomprometidos, o que lhes permite servir como hospedeiros eficazes para xenoenxertos tumorais transplantados22.
Protocolos foram desenvolvidos para enxerto tumoral em embriões de peixe-zebra, bem como em adultos, que consideraram uma série de variáveis diferentes 23,24,25,26,27. Estes exploraram vários locais de deposição tumoral em peixe-zebra, incluindo injeções na gema, espaço perivitelino e coração e em diferentes estágios de desenvolvimento 16,28. A temperatura ambiente da aquicultura para xenoenxertos de peixe-zebra também é importante, pois a criação de peixe-zebra normalmente ocorre a 28 ° C, enquanto as células de mamíferos crescem a 37 ° C. Consequentemente, uma temperatura de compromisso deve ser empregada que seja tolerada pelos peixes, mas que suporte o crescimento do tumor, e 34 ° C parece atingir ambos os objetivos29. A análise do comportamento e progressão dos tumores após o xenotransplante é outra área importante de foco, e isso envolve o uso de uma variedade de modalidades de imagem, bem como a análise de sobrevida30. Uma das principais vantagens do modelo de peixe-zebra é a disponibilidade de um grande número de animais de estudo para fornecer imenso poder estatístico aos estudos in vivo do comportamento do tumor; no entanto, as abordagens anteriores limitaram severamente esse potencial devido à necessidade de procedimentos de montagem tediosos para injeções.
Aqui, abordamos essa limitação por meio do desenvolvimento de um método simples e rápido para estadiar embriões que permite alto rendimento e monitoramento da qualidade da injeção usando a linha transparente de peixe-zebra. Isso envolve a injeção de xenoenxertos no saco vitelino dos embriões de peixe-zebra casper 2 dias após a fertilização (dpf). Observamos a sobrevivência de embriões após xenotransplante como parte da análise do comportamento tumoral. Mostramos ainda a avaliação da carga da doença após o xenotransplante por meio de suspensões de células únicas e análise por citometria de fluxo (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
O xenotransplante de peixe-zebra surgiu como uma alternativa rápida, robusta e econômica aos estudos com camundongos12. Embora várias abordagens para o xenotransplante de peixe-zebra tenham sido relatadas, nossa adaptação resultou em melhorias significativas. Além de padronizar os parâmetros em torno do procedimento, essas melhorias se concentram especificamente em acelerar a taxa na qual as injeções de tumor podem ser realizadas, permitindo assim um aumento no número de animais por bra?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por doações do NIH R37AI110985 e P30CA006927, uma dotação da Comunidade da Pensilvânia, da Sociedade de Leucemia e Linfoma e do Fundo Bishop. Este estudo também foi apoiado pelas principais instalações da Fox Chase, incluindo Cultura de Células, Citometria de Fluxo e Instalações de Animais de Laboratório. Agradecemos à Dra. Jennifer Rhodes por manter a instalação de peixe-zebra e microinjeção na FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
