Summary

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Published: July 12, 2024
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Summary

Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.

Abstract

Estudos in vivo do comportamento do tumor são um elemento básico da pesquisa do câncer; no entanto, o uso de camundongos apresenta desafios significativos em custo e tempo. Aqui, apresentamos o peixe-zebra larval como um modelo de transplante que apresenta inúmeras vantagens sobre os modelos murinos, incluindo facilidade de manuseio, baixo custo e curta duração experimental. Além disso, a ausência de um sistema imunológico adaptativo durante os estágios larvais evita a necessidade de gerar e usar cepas imunodeficientes. Embora existam protocolos estabelecidos para xenotransplante em embriões de peixe-zebra, apresentamos aqui um método aprimorado envolvendo o estadiamento embrionário para transferência mais rápida, análise de sobrevivência e o uso de citometria de fluxo para avaliar a carga da doença. Os embriões são preparados para facilitar a injeção rápida de células na gema das larvas e a marcação celular para monitorar a consistência do bolo celular injetado. Após a injeção, a análise de sobrevivência do embrião é avaliada até 7 dias após a injeção (dpi). Finalmente, a carga da doença também é avaliada marcando as células transferidas com uma proteína fluorescente e análise por citometria de fluxo. A citometria de fluxo é possibilitada por um método padronizado de preparação de suspensões celulares de embriões de peixe-zebra, que também pode ser usado no estabelecimento da cultura primária de células de peixe-zebra. Em resumo, o procedimento descrito aqui permite uma avaliação mais rápida do comportamento das células tumorais in vivo com maior número de animais por braço de estudo e de maneira mais econômica.

Introduction

A análise do comportamento dos tumores em resposta à alteração genética ou ao tratamento medicamentoso in vivo é um elemento essencial da pesquisa do câncer 1,2,3,4. Tais estudos geralmente envolvem o uso de modelos de camundongos imunocomprometidos (Mus musculus)5; No entanto, os estudos de xenotransplante em camundongos são limitados em muitos aspectos, incluindo capacidade limitada, duração prolongada, despesas significativas e a necessidade de equipamentos de imagem sofisticados para monitorar a progressão de tumores internos 6,7. Por outro lado, o modelo zebrafish (Danio rerio) permite maior capacidade, menor duração, menor gasto e, devido à sua transparência, monitoramento simples da progressão da doença 8,9.

O peixe-zebra é um sistema modelo de vertebrado bem desenvolvido com desenvolvimento ex-útero e alta fecundidade, com fêmeas individuais produzindo mais de 100 embriões10. Além disso, os embriões de peixe-zebra são transparentes, permitindo fácil visualização dos processos de desenvolvimento usando técnicas relacionadas à fluorescência, como repórteres. Finalmente, a conservação de processos críticos de desenvolvimento os torna um modelo ideal para muitos tipos de estudos, incluindo o comportamento de células malignas transplantadas 11,12. Os embriões de peixe-zebra do tipo selvagem desenvolvem melanócitos, que os tornam opticamente opacos às 2 semanas de idade, mas isso foi superado pela geração de embriões de casper (roya9; mitfaw2), que permanecem transparentes ao longo da vida13. Devido às suas propriedades ópticas, o peixe-zebra casper é um receptor ideal de células tumorais transplantadas 14,15,16. O xenotransplante de células tumorais em peixe-zebra ganhou importância nas últimas 2 décadas 17,18,19,20,21. Os embriões de peixe-zebra têm imunidade inata; no entanto, eles carecem de imunidade adaptativa durante o estágio larval, tornando-os funcionalmente imunocomprometidos, o que lhes permite servir como hospedeiros eficazes para xenoenxertos tumorais transplantados22.

Protocolos foram desenvolvidos para enxerto tumoral em embriões de peixe-zebra, bem como em adultos, que consideraram uma série de variáveis diferentes 23,24,25,26,27. Estes exploraram vários locais de deposição tumoral em peixe-zebra, incluindo injeções na gema, espaço perivitelino e coração e em diferentes estágios de desenvolvimento 16,28. A temperatura ambiente da aquicultura para xenoenxertos de peixe-zebra também é importante, pois a criação de peixe-zebra normalmente ocorre a 28 ° C, enquanto as células de mamíferos crescem a 37 ° C. Consequentemente, uma temperatura de compromisso deve ser empregada que seja tolerada pelos peixes, mas que suporte o crescimento do tumor, e 34 ° C parece atingir ambos os objetivos29. A análise do comportamento e progressão dos tumores após o xenotransplante é outra área importante de foco, e isso envolve o uso de uma variedade de modalidades de imagem, bem como a análise de sobrevida30. Uma das principais vantagens do modelo de peixe-zebra é a disponibilidade de um grande número de animais de estudo para fornecer imenso poder estatístico aos estudos in vivo do comportamento do tumor; no entanto, as abordagens anteriores limitaram severamente esse potencial devido à necessidade de procedimentos de montagem tediosos para injeções.

Aqui, abordamos essa limitação por meio do desenvolvimento de um método simples e rápido para estadiar embriões que permite alto rendimento e monitoramento da qualidade da injeção usando a linha transparente de peixe-zebra. Isso envolve a injeção de xenoenxertos no saco vitelino dos embriões de peixe-zebra casper 2 dias após a fertilização (dpf). Observamos a sobrevivência de embriões após xenotransplante como parte da análise do comportamento tumoral. Mostramos ainda a avaliação da carga da doença após o xenotransplante por meio de suspensões de células únicas e análise por citometria de fluxo (Figura 1).

Protocol

A manutenção, alimentação e criação do peixe-zebra ocorreram em condições padrão de aquicultura a 28,5 ° C, conforme descrito31. Todos os experimentos relacionados ao peixe-zebra foram feitos nessa temperatura; no entanto, após o xenotransplante, os animais foram cultivados a 34 °C durante o experimento, de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). 1. Reprodução (3 dias antes da injeção)<…

Representative Results

XenotransplanteUma visão abrangente de todo o experimento e análise é representada na Figura 1, abrangendo desde a produção de embriões até a avaliação da progressão da doença por análise de sobrevivência e carga de doença por citometria de fluxo. Essa abordagem traz várias melhorias que aumentam a reprodutibilidade e escalabilidade do xenotransplante, além de adicionar uma nova maneira de avaliar a carga da doença. O sucesso desses experimentos é altam…

Discussion

O xenotransplante de peixe-zebra surgiu como uma alternativa rápida, robusta e econômica aos estudos com camundongos12. Embora várias abordagens para o xenotransplante de peixe-zebra tenham sido relatadas, nossa adaptação resultou em melhorias significativas. Além de padronizar os parâmetros em torno do procedimento, essas melhorias se concentram especificamente em acelerar a taxa na qual as injeções de tumor podem ser realizadas, permitindo assim um aumento no número de animais por bra?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por doações do NIH R37AI110985 e P30CA006927, uma dotação da Comunidade da Pensilvânia, da Sociedade de Leucemia e Linfoma e do Fundo Bishop. Este estudo também foi apoiado pelas principais instalações da Fox Chase, incluindo Cultura de Células, Citometria de Fluxo e Instalações de Animais de Laboratório. Agradecemos à Dra. Jennifer Rhodes por manter a instalação de peixe-zebra e microinjeção na FCCC.

Materials

1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma P7629
70 micron cell strainer Corning  CLS431751-50EA
90 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific S43565
Agarose Apex bioresearch 20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody Biolegend 109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer BD Biosciences BD FACSymphony A5
calibration capillaries Sigma  P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye Invitrogen C7001
Collageanse IV Gibco 17104019
Dumont forceps number 55 Fine science tools 11255-20
FBS Corning  35-015-CV
Fluorescence microscope Nikon model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate) World precision instruments 1B100-4
HBSS Corning  21-023-CV
Helix NP Blue Biolegend 425305
Instant Ocean Sea Salt Instant ocean SS15-10
Light microscope Nikon model SMZ1000
Methylene blue Sigma M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells) eppendorf 930001007
P1000 micropipette puller Sutter instruments model P-97
PM 1000 cell microinjector MicroData Instruments, Inc. (MDI) PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) Sigma E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) Zeigler 388763

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Verma, M., Rhodes, M., Shinton, S., Wiest, D. L. A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (209), e66164, doi:10.3791/66164 (2024).

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