Простой, быстрый и эффективный метод анализа ксенотрансплантации опухолей у прозрачных эмбрионов рыбок данио
Summary
Мы описываем протокол ксенотрансплантации в желток прозрачных эмбрионов данио-рерио, который оптимизируется с помощью простого и быстрого метода стадирования. Постинъекционный анализ включает в себя выживаемость и оценку бремени болезни ксенотрансплантированных клеток с помощью проточной цитометрии.
Abstract
Исследования поведения опухоли in vivo являются одним из основных элементов исследований рака; Тем не менее, использование мышей сопряжено со значительными проблемами с точки зрения затрат и времени. Здесь мы представляем личинок данио-рерио в качестве модели для трансплантации, которая имеет множество преимуществ по сравнению с мышиными моделями, включая простоту в обращении, низкую стоимость и короткую продолжительность эксперимента. Более того, отсутствие адаптивной иммунной системы на личиночной стадии избавляет от необходимости генерировать и использовать иммунодефицитные штаммы. Несмотря на то, что существуют установленные протоколы ксенотрансплантации эмбрионов рыбок данио, мы представляем здесь усовершенствованный метод, включающий стадирование эмбрионов для более быстрого переноса, анализ выживаемости и использование проточной цитометрии для оценки бремени заболевания. Эмбрионы стадируются для обеспечения быстрой инъекции клеток в желток личинок и маркировки клеток для контроля консистенции вводимого клеточного болюса. После инъекции анализ выживаемости эмбрионов оценивается в течение 7 дней после инъекции (dpi). Наконец, бремя болезни также оценивается путем маркировки перенесенных клеток флуоресцентным белком и анализа с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия стала возможной благодаря стандартизированному методу получения клеточных суспензий из эмбрионов рыбок данио, которые также могут быть использованы для создания первичной культуры клеток рыбок данио. Таким образом, описанная здесь процедура позволяет более быстро оценить поведение опухолевых клеток in vivo с большим числом животных на исследуемую группу и более экономически эффективным способом.
Introduction
Анализ поведения опухолей в ответ на генетические изменения или медикаментозное лечение in vivo является важным элементом исследования рака 1,2,3,4. В таких исследованиях чаще всего используются модели мышей с ослабленным иммунитетом (Mus musculus)5; Тем не менее, исследования ксенотрансплантации на мышах ограничены во многих отношениях, включая ограниченные возможности, увеличенную продолжительность, значительную стоимость и потребность в сложном оборудовании для визуализации для мониторинга прогрессирования внутренних опухолей 6,7. В отличие от этого, модель рыбок данио (Danio rerio) обеспечивает большую емкость, более короткую продолжительность, меньшие затраты и, благодаря своей прозрачности, простой мониторинг прогрессирования заболевания 8,9.
Данио-рерио представляет собой хорошо развитую модельную систему позвоночных с внутриутробным развитием и высокой плодовитостью, при этом отдельные самки производят более100 эмбрионов10. Кроме того, эмбрионы рыбок данио прозрачны, что позволяет легко визуализировать процессы развития с помощью методов, связанных с флуоресценцией, таких как репортеры. Наконец, сохранение критических процессов развития делает их идеальной моделью для многих типов исследований, включая поведение трансплантированных злокачественныхклеток. Эмбрионы рыбок данио дикого типа развивают меланоциты, которые делают их оптически непрозрачными к 2-недельному возрасту, но это было преодолено за счет генерации эмбрионов каспера (roya9; mitfaw2), которые остаются прозрачными на протяжении всей жизни13. Благодаря своим оптическим свойствам, рыбки данио являются идеальными реципиентами трансплантированных опухолевых клеток 14,15,16. Ксенотрансплантация опухолевых клеток рыбкам данио приобрела значение в последние 2 десятилетия 17,18,19,20,21. Эмбрионы рыбок данио обладают врожденным иммунитетом; Тем не менее, у них отсутствует адаптивный иммунитет на личиночной стадии, что делает их функционально ослабленными, что позволяет им служить эффективными хозяевами для трансплантированных опухолевых ксенотрансплантатов22.
Были разработаны протоколы приживления опухолей у эмбрионов рыбок данио, а также у взрослых особей, которые учитывали ряд различных переменных 23,24,25,26,27. Они исследовали многочисленные участки отложения опухолей у рыбок данио, включая инъекции в желток, перивителлиновое пространство и сердце, а также на разных стадиях развития 16,28. Температура окружающей среды в аквакультуре для ксенотрансплантатов данио-рерио также важна, поскольку выращивание рыбок данио обычно происходит при 28 °C, в то время как клетки млекопитающих растут при 37 °C. Следовательно, должна быть использована компромиссная температура, которая хорошо переносится рыбами, но способствует росту опухоли, и 34 °C, по-видимому, достигает обеих целей. Анализ поведения и прогрессирования опухолей после ксенотрансплантации является еще одной важной областью внимания, и это включает в себя использование различных методов визуализации, атакже анализ выживаемости. Одним из основных преимуществ модели рыбок данио является наличие большого количества исследуемых животных, что обеспечивает огромную статистическую мощность для исследований поведения опухолей in vivo; Однако предыдущие подходы сильно ограничивали этот потенциал из-за необходимости утомительных процедур монтажа для инъекций.
В данной работе мы устраняем это ограничение, разрабатывая простой и быстрый метод определения стадии эмбрионов, который обеспечивает высокую производительность и контроль качества инъекций с использованием прозрачной линии casper данио-рерио. Это влечет за собой введение ксенотрансплантатов в желточный мешок эмбрионов каспера данио-рерио через 2 дня после оплодотворения (DPF). Мы наблюдаем за выживаемостью эмбрионов после ксенотрансплантации в рамках анализа поведения опухоли. Кроме того, мы показываем оценку бремени болезни после ксенотрансплантации путем создания суспензий одиночных клеток и анализа с помощью проточной цитометрии (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ксенотрансплантация данио-рерио стала быстрой, надежной и экономически эффективной альтернативой исследованиям на мышах12. Несмотря на то, что сообщалось о нескольких подходах к ксенотрансплантации рыбок данио, наша адаптация привела к значительным улучшениям. В дополне?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH R37AI110985 и P30CA006927, ассигнованиями от Содружества Пенсильвании, Общества лейкемии и лимфомы и Фонда Бишопа. Это исследование также было поддержано основными объектами Fox Chase, включая Cell Culture, Flow Cytometry и Laboratory Animal facility. Мы благодарим доктора Дженнифер Роудс за содержание рыбок данио и микроинъекций в FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
