Summary

Простой, быстрый и эффективный метод анализа ксенотрансплантации опухолей у прозрачных эмбрионов рыбок данио

Published: July 12, 2024
doi:

Summary

Мы описываем протокол ксенотрансплантации в желток прозрачных эмбрионов данио-рерио, который оптимизируется с помощью простого и быстрого метода стадирования. Постинъекционный анализ включает в себя выживаемость и оценку бремени болезни ксенотрансплантированных клеток с помощью проточной цитометрии.

Abstract

Исследования поведения опухоли in vivo являются одним из основных элементов исследований рака; Тем не менее, использование мышей сопряжено со значительными проблемами с точки зрения затрат и времени. Здесь мы представляем личинок данио-рерио в качестве модели для трансплантации, которая имеет множество преимуществ по сравнению с мышиными моделями, включая простоту в обращении, низкую стоимость и короткую продолжительность эксперимента. Более того, отсутствие адаптивной иммунной системы на личиночной стадии избавляет от необходимости генерировать и использовать иммунодефицитные штаммы. Несмотря на то, что существуют установленные протоколы ксенотрансплантации эмбрионов рыбок данио, мы представляем здесь усовершенствованный метод, включающий стадирование эмбрионов для более быстрого переноса, анализ выживаемости и использование проточной цитометрии для оценки бремени заболевания. Эмбрионы стадируются для обеспечения быстрой инъекции клеток в желток личинок и маркировки клеток для контроля консистенции вводимого клеточного болюса. После инъекции анализ выживаемости эмбрионов оценивается в течение 7 дней после инъекции (dpi). Наконец, бремя болезни также оценивается путем маркировки перенесенных клеток флуоресцентным белком и анализа с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия стала возможной благодаря стандартизированному методу получения клеточных суспензий из эмбрионов рыбок данио, которые также могут быть использованы для создания первичной культуры клеток рыбок данио. Таким образом, описанная здесь процедура позволяет более быстро оценить поведение опухолевых клеток in vivo с большим числом животных на исследуемую группу и более экономически эффективным способом.

Introduction

Анализ поведения опухолей в ответ на генетические изменения или медикаментозное лечение in vivo является важным элементом исследования рака 1,2,3,4. В таких исследованиях чаще всего используются модели мышей с ослабленным иммунитетом (Mus musculus)5; Тем не менее, исследования ксенотрансплантации на мышах ограничены во многих отношениях, включая ограниченные возможности, увеличенную продолжительность, значительную стоимость и потребность в сложном оборудовании для визуализации для мониторинга прогрессирования внутренних опухолей 6,7. В отличие от этого, модель рыбок данио (Danio rerio) обеспечивает большую емкость, более короткую продолжительность, меньшие затраты и, благодаря своей прозрачности, простой мониторинг прогрессирования заболевания 8,9.

Данио-рерио представляет собой хорошо развитую модельную систему позвоночных с внутриутробным развитием и высокой плодовитостью, при этом отдельные самки производят более100 эмбрионов10. Кроме того, эмбрионы рыбок данио прозрачны, что позволяет легко визуализировать процессы развития с помощью методов, связанных с флуоресценцией, таких как репортеры. Наконец, сохранение критических процессов развития делает их идеальной моделью для многих типов исследований, включая поведение трансплантированных злокачественныхклеток. Эмбрионы рыбок данио дикого типа развивают меланоциты, которые делают их оптически непрозрачными к 2-недельному возрасту, но это было преодолено за счет генерации эмбрионов каспера (roya9; mitfaw2), которые остаются прозрачными на протяжении всей жизни13. Благодаря своим оптическим свойствам, рыбки данио являются идеальными реципиентами трансплантированных опухолевых клеток 14,15,16. Ксенотрансплантация опухолевых клеток рыбкам данио приобрела значение в последние 2 десятилетия 17,18,19,20,21. Эмбрионы рыбок данио обладают врожденным иммунитетом; Тем не менее, у них отсутствует адаптивный иммунитет на личиночной стадии, что делает их функционально ослабленными, что позволяет им служить эффективными хозяевами для трансплантированных опухолевых ксенотрансплантатов22.

Были разработаны протоколы приживления опухолей у эмбрионов рыбок данио, а также у взрослых особей, которые учитывали ряд различных переменных 23,24,25,26,27. Они исследовали многочисленные участки отложения опухолей у рыбок данио, включая инъекции в желток, перивителлиновое пространство и сердце, а также на разных стадиях развития 16,28. Температура окружающей среды в аквакультуре для ксенотрансплантатов данио-рерио также важна, поскольку выращивание рыбок данио обычно происходит при 28 °C, в то время как клетки млекопитающих растут при 37 °C. Следовательно, должна быть использована компромиссная температура, которая хорошо переносится рыбами, но способствует росту опухоли, и 34 °C, по-видимому, достигает обеих целей. Анализ поведения и прогрессирования опухолей после ксенотрансплантации является еще одной важной областью внимания, и это включает в себя использование различных методов визуализации, атакже анализ выживаемости. Одним из основных преимуществ модели рыбок данио является наличие большого количества исследуемых животных, что обеспечивает огромную статистическую мощность для исследований поведения опухолей in vivo; Однако предыдущие подходы сильно ограничивали этот потенциал из-за необходимости утомительных процедур монтажа для инъекций.

В данной работе мы устраняем это ограничение, разрабатывая простой и быстрый метод определения стадии эмбрионов, который обеспечивает высокую производительность и контроль качества инъекций с использованием прозрачной линии casper данио-рерио. Это влечет за собой введение ксенотрансплантатов в желточный мешок эмбрионов каспера данио-рерио через 2 дня после оплодотворения (DPF). Мы наблюдаем за выживаемостью эмбрионов после ксенотрансплантации в рамках анализа поведения опухоли. Кроме того, мы показываем оценку бремени болезни после ксенотрансплантации путем создания суспензий одиночных клеток и анализа с помощью проточной цитометрии (рис. 1).

Protocol

Содержание, кормление и разведение рыбок данио-рерио происходило в стандартных условиях аквакультуры при температуре 28,5 °C, как описано31. Все эксперименты, связанные с рыбками данио, проводились при этой температуре; однако после ксенотрансплантации животных культивиров?…

Representative Results

КсенотрансплантацияНа рисунке 1 представлен полный обзор всего эксперимента и анализа, охватывающего все этапы от производства эмбрионов до оценки прогрессирования заболевания с помощью анализа выживаемости и бремени заболевания с помощью проточной цито?…

Discussion

Ксенотрансплантация данио-рерио стала быстрой, надежной и экономически эффективной альтернативой исследованиям на мышах12. Несмотря на то, что сообщалось о нескольких подходах к ксенотрансплантации рыбок данио, наша адаптация привела к значительным улучшениям. В дополне?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами NIH R37AI110985 и P30CA006927, ассигнованиями от Содружества Пенсильвании, Общества лейкемии и лимфомы и Фонда Бишопа. Это исследование также было поддержано основными объектами Fox Chase, включая Cell Culture, Flow Cytometry и Laboratory Animal facility. Мы благодарим доктора Дженнифер Роудс за содержание рыбок данио и микроинъекций в FCCC.

Materials

1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma P7629
70 micron cell strainer Corning  CLS431751-50EA
90 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific S43565
Agarose Apex bioresearch 20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody Biolegend 109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer BD Biosciences BD FACSymphony A5
calibration capillaries Sigma  P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye Invitrogen C7001
Collageanse IV Gibco 17104019
Dumont forceps number 55 Fine science tools 11255-20
FBS Corning  35-015-CV
Fluorescence microscope Nikon model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate) World precision instruments 1B100-4
HBSS Corning  21-023-CV
Helix NP Blue Biolegend 425305
Instant Ocean Sea Salt Instant ocean SS15-10
Light microscope Nikon model SMZ1000
Methylene blue Sigma M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells) eppendorf 930001007
P1000 micropipette puller Sutter instruments model P-97
PM 1000 cell microinjector MicroData Instruments, Inc. (MDI) PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) Sigma E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) Zeigler 388763

References

  1. Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
  2. Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
  3. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
  4. Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
  5. Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
  6. Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
  7. Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
  8. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
  9. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  10. Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
  11. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  12. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
  13. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  14. Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
  15. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  16. Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
  17. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
  18. Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
  19. Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
  20. Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
  21. Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
  22. Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  23. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  24. Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
  25. Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
  26. Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
  27. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
  28. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
  29. Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
  30. Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  32. Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
  33. Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
  34. Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
  35. Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
  36. Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
  37. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
  38. Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).

Play Video

Cite This Article
Verma, M., Rhodes, M., Shinton, S., Wiest, D. L. A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (209), e66164, doi:10.3791/66164 (2024).

View Video