Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra
Summary
Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.
Abstract
Los estudios in vivo del comportamiento tumoral son un elemento básico de la investigación del cáncer; Sin embargo, el uso de ratones presenta desafíos significativos en costo y tiempo. Aquí, presentamos larvas de pez cebra como un modelo de trasplante que tiene numerosas ventajas sobre los modelos murinos, incluida la facilidad de manejo, el bajo costo y la corta duración experimental. Además, la ausencia de un sistema inmune adaptativo durante las etapas larvales obvia la necesidad de generar y utilizar cepas inmunodeficientes. Si bien existen protocolos establecidos para el xenotrasplante en embriones de pez cebra, presentamos aquí un método mejorado que involucra la estadificación del embrión para una transferencia más rápida, el análisis de supervivencia y el uso de la citometría de flujo para evaluar la carga de la enfermedad. Los embriones se organizan en etapas para facilitar la inyección rápida de células en la yema de las larvas y el marcado celular para controlar la consistencia del bolo celular inyectado. Después de la inyección, se evalúa el análisis de supervivencia embrionaria hasta 7 días después de la inyección (ppp). Por último, también se evalúa la carga de enfermedad marcando las células transferidas con una proteína fluorescente y analizándolas mediante citometría de flujo. La citometría de flujo es posible gracias a un método estandarizado de preparación de suspensiones celulares de embriones de pez cebra, que también podría usarse para establecer el cultivo primario de células de pez cebra. En resumen, el procedimiento descrito aquí permite una evaluación más rápida del comportamiento de las células tumorales in vivo con un mayor número de animales por brazo de estudio y de una manera más rentable.
Introduction
El análisis del comportamiento de los tumores en respuesta a una alteración genética o al tratamiento farmacológico in vivo es un elemento esencial de la investigación del cáncer 1,2,3,4. En la mayoría de los casos, estos estudios implican el uso de modelos de ratón inmunocomprometidos (Mus musculus)5; Sin embargo, los estudios de xenotrasplantes en ratones son limitados en muchos aspectos, incluyendo la capacidad limitada, la duración prolongada, el gasto significativo y la necesidad de equipos de imagen sofisticados para monitorear la progresión de los tumores internos 6,7. Por el contrario, el modelo de pez cebra (Danio rerio) permite una mayor capacidad, menor duración, menor gasto y, debido a su transparencia, un seguimiento sencillo de la progresión de la enfermedad 8,9.
El pez cebra es un sistema modelo de vertebrados bien desarrollado con desarrollo ex-útero y alta fecundidad, con hembras individuales que producen más de 100 embriones10. Además, los embriones de pez cebra son transparentes, lo que permite una fácil visualización de los procesos de desarrollo utilizando técnicas relacionadas con la fluorescencia, como los reporteros. Finalmente, la conservación de los procesos críticos de desarrollo los convierte en un modelo ideal para muchos tipos de estudios, incluyendo el comportamiento de las células malignas trasplantadas11,12. Los embriones de pez cebra de tipo salvaje desarrollan melanocitos, que los vuelven ópticamente opacos a las 2 semanas de edad, pero esto se ha superado con la generación de embriones de casper (Roya9; mitfaw2), que permanecen transparentes a lo largo de la vida13. Debido a sus propiedades ópticas, el pez cebra casper es un receptor ideal de células tumorales trasplantadas 14,15,16. El xenotrasplante de células tumorales en pez cebra ha ganado importancia en las últimas 2 décadas 17,18,19,20,21. Los embriones de pez cebra tienen inmunidad innata; Sin embargo, carecen de inmunidad adaptativa durante su etapa larvaria, lo que los hace funcionalmente inmunocomprometidos, lo que les permite servir como huéspedes efectivos para xenoinjertos tumorales trasplantados22.
Se han desarrollado protocolos para el injerto tumoral en embriones de pez cebra y en adultos que han considerado una serie de variables diferentes 23,24,25,26,27. Estos han explorado numerosos sitios de depósito tumoral en el pez cebra, incluyendo inyecciones en la yema, el espacio perivitelino y el corazón y en diferentes etapas del desarrollo16,28. La temperatura ambiente de la acuicultura para los xenoinjertos de pez cebra también es importante, ya que la cría del pez cebra suele producirse a 28 °C, mientras que las células de los mamíferos crecen a 37 °C. En consecuencia, se debe emplear una temperatura de compromiso que sea tolerada por los peces pero que apoye el crecimiento tumoral, y 34 °C parece lograr ambos objetivos29. El análisis del comportamiento y la progresión de los tumores después de un xenotrasplante es otra área importante de interés, y esto implica el uso de una variedad de modalidades de imagen, así como el análisis de la supervivencia30. Una de las principales ventajas del modelo de pez cebra es la disponibilidad de un gran número de animales de estudio para proporcionar un inmenso poder estadístico a los estudios in vivo del comportamiento tumoral; Sin embargo, los enfoques anteriores han limitado severamente este potencial debido al requisito de tediosos procedimientos de montaje para las inyecciones.
Aquí, abordamos esta limitación a través del desarrollo de un método simple y rápido con el que organizar embriones que permite un alto rendimiento y monitoreo de la calidad de la inyección utilizando la línea transparente de pez cebra casper . Esto implica la inyección de xenoinjertos en el saco vitelino de los embriones de pez cebra casper a los 2 días después de la fertilización (dpf). Observamos la supervivencia de los embriones después del xenotrasplante como parte del análisis del comportamiento tumoral. Además, mostramos la evaluación de la carga de enfermedad tras el xenotrasplante mediante la realización de suspensiones unicelulares y el análisis mediante citometría de flujo (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
El xenotrasplante de pez cebra ha surgido como una alternativa rápida, robusta y rentable a los estudios con ratones12. Aunque se han descrito varios enfoques para el xenotrasplante de pez cebra, nuestra adaptación ha dado lugar a mejoras significativas. Además de estandarizar los parámetros en torno al procedimiento, estas mejoras se centran específicamente en acelerar la velocidad a la que se pueden realizar las inyecciones tumorales, lo que permite un aumento en el número de animales por …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH R37AI110985 y P30CA006927, una asignación de la Mancomunidad de Pensilvania, la Sociedad de Leucemia y Linfoma y el Fondo Bishop. Este estudio también contó con el apoyo de las instalaciones principales de Fox Chase, incluidas las instalaciones de cultivo celular, citometría de flujo y animales de laboratorio. Agradecemos a la Dra. Jennifer Rhodes por mantener las instalaciones de pez cebra y microinyección en FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
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