En enkel, snabb och effektiv metod för analys av tumörxenotransplantation i transparenta zebrafiskembryon
Summary
Vi beskriver ett protokoll för xenotransplantation till äggulan hos genomskinliga zebrafiskembryon som optimeras med en enkel, snabb stadieindelningsmetod. Analyser efter injektion inkluderar överlevnad och bedömning av sjukdomsbördan hos xenotransplanterade celler med hjälp av flödescytometri.
Abstract
In vivo-studier av tumörbeteende är en viktig del av cancerforskningen. Användningen av möss innebär dock stora utmaningar när det gäller kostnad och tid. Här presenterar vi zebrafisklarver som en transplantationsmodell som har många fördelar jämfört med murina modeller, inklusive enkel hantering, låg kostnad och kort experimentell varaktighet. Dessutom undanröjer frånvaron av ett adaptivt immunsystem under larvstadierna behovet av att generera och använda immunbristfälliga stammar. Även om det finns etablerade protokoll för xenotransplantation i zebrafiskembryon, presenterar vi här en förbättrad metod som involverar embryostadieindelning för snabbare överföring, överlevnadsanalys och användning av flödescytometri för att bedöma sjukdomsbördan. Embryon iscensätts för att underlätta snabb cellinjektion i larvens äggula och cellmärkning för att övervaka konsistensen hos den injicerade cellbolusen. Efter injektionen bedöms embryoöverlevnadsanalysen upp till 7 dagar efter injektionen (dpi). Slutligen bedöms sjukdomsbördan också genom att märka överförda celler med ett fluorescerande protein och analysera dem med flödescytometri. Flödescytometri möjliggörs av en standardiserad metod för att framställa cellsuspensioner från zebrafiskembryon, som också kan användas för att etablera den primära odlingen av zebrafiskceller. Sammanfattningsvis möjliggör den procedur som beskrivs här en snabbare bedömning av tumörcellers beteende in vivo med ett större antal djur per studiearm och på ett mer kostnadseffektivt sätt.
Introduction
Analys av tumörers beteende som svar på genetisk förändring eller läkemedelsbehandling in vivo är en viktig del av cancerforskningen 1,2,3,4. Sådana studier involverar oftast användning av immunsupprimerade musmodeller (Mus musculus)5; Xenotransplantationsstudier på möss är dock begränsade i många avseenden, inklusive begränsad kapacitet, förlängd varaktighet, betydande kostnader och krav på sofistikerad avbildningsutrustning för att övervaka utvecklingen av interna tumörer 6,7. Däremot möjliggör zebrafiskmodellen (Danio rerio) större kapacitet, kortare varaktighet, lägre kostnad och, på grund av deras transparens, enkel övervakning av sjukdomsprogression 8,9.
Zebrafisk är ett välutvecklat modellsystem för ryggradsdjur med ex-utero-utveckling och hög fruktsamhet, med enskilda honor som producerar mer än 100 embryon10. Dessutom är zebrafiskembryon transparenta, vilket gör det enkelt att visualisera utvecklingsprocesser med hjälp av fluorescensrelaterade tekniker som reporters. Slutligen gör bevarandet av kritiska utvecklingsprocesser dem till en idealisk modell för många typer av studier, inklusive beteendet hos transplanterade maligna celler11,12. Zebrafiskembryon av vildtyp utvecklar melanocyter, vilket gör dem optiskt ogenomskinliga vid 2 veckors ålder, men detta har övervunnits genom genereringen av Casper-embryon (royA9; mitfaW2), som förblir transparenta under hela livet13. På grund av sina optiska egenskaper är casperzebrafiskar idealiska mottagare av transplanterade tumörceller 14,15,16. Xenotransplantation av tumörceller till zebrafiskar har fått ökad betydelse under de senaste 2 decennierna 17,18,19,20,21. Zebrafiskembryon har ett medfött immunförsvar; De saknar dock adaptiv immunitet under larvstadiet, vilket gör dem funktionellt immunsupprimerade, vilket gör att de kan fungera som effektiva värdar för transplanterade tumörxenografter22.
Protokoll har utvecklats för tumörbildning i zebrafiskembryon såväl som vuxna som har tagit hänsyn till ett antal olika variabler 23,24,25,26,27. Dessa har utforskat ett flertal platser för tumöravsättning hos zebrafiskar, inklusive injektioner i äggula, peri-vitellinutrymme och hjärta och vid olika utvecklingsstadier16,28. Omgivningstemperaturen i vattenbruket för zebrafiskxenografter är också viktig, eftersom zebrafiskuppfödning vanligtvis sker vid 28 °C, medan däggdjursceller växer vid 37 °C. Följaktligen måste man använda en kompromisstemperatur som tolereras av fisken men som ändå stöder tumörtillväxten, och 34 °C verkar uppnå båda målen29. Analys av tumörers beteende och progression efter xenotransplantation är ett annat viktigt fokusområde, och detta involverar användning av en mängd olika avbildningsmodaliteter samt överlevnadsanalys30. En av de stora fördelarna med zebrafiskmodellen är tillgången till ett stort antal försöksdjur för att ge enorm statistisk styrka till in vivo-studier av tumörbeteende; Tidigare tillvägagångssätt har dock kraftigt begränsat denna potential på grund av kravet på omständliga monteringsprocedurer för injektioner.
Här adresserar vi denna begränsning genom att utveckla en enkel, snabb metod för att stadieindela embryon som möjliggör hög genomströmning och övervakning av injektionskvalitet med hjälp av den transparenta casper-zebrafisklinjen. Detta innebär att xenotransplantat injiceras i gulesäcken hos casperzebrafiskembryon 2 dagar efter befruktning (dpf). Vi observerar överlevnaden hos embryon efter xenotransplantation som en del av analys av tumörbeteende. Vi visar vidare bedömningen av sjukdomsbörda efter xenotransplantation genom att göra encellssuspensioner och analysera genom flödescytometri (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenotransplantation av zebrafisk har visat sig vara ett snabbt, robust och kostnadseffektivt alternativ till musstudier12. Även om flera metoder för xenotransplantation av zebrafiskar har rapporterats, har vår anpassning resulterat i betydande förbättringar. Förutom att standardisera parametrarna kring ingreppet fokuserar dessa förbättringar specifikt på att påskynda hastigheten med vilken tumörinjektioner kan utföras, vilket möjliggör en ökning av antalet djur per studiearm och anv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH-anslag R37AI110985 och P30CA006927, ett anslag från Commonwealth of Pennsylvania, Leukemia and Lymphoma Society och Bishop Fund. Denna studie stöddes också av kärnfaciliteterna vid Fox Chase, inklusive cellodling, flödescytometri och försöksdjur. Vi tackar Dr. Jennifer Rhodes för att ha underhållit zebrafisk- och mikroinjektionsanläggningen vid FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
