Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem
Summary
Şeffaf zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ksenotransplantasyon için basit, hızlı bir evreleme yöntemi ile optimize edilmiş bir protokol tarif ediyoruz. Enjeksiyon sonrası analizler, akış sitometrisi ile ksenotransplante edilen hücrelerin sağkalımını ve hastalık yükünün değerlendirilmesini içerir.
Abstract
Tümör davranışı üzerine in vivo çalışmalar, kanser araştırmalarının temelini oluşturur; Bununla birlikte, farelerin kullanımı maliyet ve zaman açısından önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, larva zebra balığını, fare modellerine göre kullanım kolaylığı, düşük maliyet ve kısa deney süresi dahil olmak üzere sayısız avantaja sahip bir nakil modeli olarak sunuyoruz. Ayrıca, larva aşamalarında adaptif bir bağışıklık sisteminin olmaması, immün yetmezliği olan suşların üretilmesi ve kullanılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Zebra balığı embriyolarında ksenotransplantasyon için yerleşik protokoller mevcut olsa da, burada daha hızlı transfer için embriyo evrelemesi, sağkalım analizi ve hastalık yükünü değerlendirmek için akış sitometrisinin kullanımını içeren gelişmiş bir yöntem sunuyoruz. Embriyolar, larvaların sarısına hızlı hücre enjeksiyonunu ve enjekte edilen hücre bolusunun kıvamını izlemek için hücre işaretlemesini kolaylaştırmak için aşamalanır. Enjeksiyondan sonra, embriyo sağkalım analizi, enjeksiyondan 7 gün sonrasına kadar değerlendirilir (dpi). Son olarak, transfer edilen hücrelerin bir floresan proteini ile işaretlenmesi ve akış sitometrisi ile analiz edilmesiyle hastalık yükü de değerlendirilir. Akış sitometrisi, zebra balığı hücrelerinin birincil kültürünün oluşturulmasında da kullanılabilen, zebra balığı embriyolarından hücre süspansiyonlarının hazırlanması için standartlaştırılmış bir yöntemle sağlanır. Özetle, burada açıklanan prosedür, tümör hücrelerinin davranışının in vivo olarak çalışma kolu başına daha fazla sayıda hayvanla ve daha uygun maliyetli bir şekilde daha hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Introduction
Genetik değişikliğe veya in vivo ilaç tedavisine yanıt olarak tümörlerin davranışının analizi, kanser araştırmalarının önemli bir unsurudur 1,2,3,4. Bu tür çalışmalar çoğunlukla bağışıklığı baskılanmış fare (Mus musculus) modellerininkullanımını içerir 5; Bununla birlikte, farelerde ksenotransplantasyon çalışmaları, sınırlı kapasite, uzun süre, önemli masraf ve iç tümörlerin ilerlemesini izlemek için sofistike görüntüleme ekipmanı gereksinimi dahil olmak üzere birçok açıdan sınırlıdır 6,7. Buna karşılık, zebra balığı modeli (Danio rerio) daha fazla kapasite, daha kısa süre, daha düşük masraf ve şeffaflıkları sayesinde hastalığın ilerlemesinin basit bir şekilde izlenmesini sağlar 8,9.
Zebra balığı, rahim dışı gelişimi ve yüksek doğurganlığa sahip, bireysel dişilerin 100’den fazla embriyo ürettiği iyi gelişmiş bir omurgalı model sistemidir10. Ayrıca, zebra balığı embriyoları şeffaftır ve raportörler gibi floresanla ilgili teknikler kullanılarak gelişimsel süreçlerin kolayca görselleştirilmesini sağlar. Son olarak, kritik gelişimsel süreçlerin korunması, onları nakledilen malign hücrelerin davranışı da dahil olmak üzere birçok çalışma türü için ideal bir model haline getirir11,12. Yabani tip zebra balığı embriyoları, onları 2 haftalıkken optik olarak opak hale getiren melanositler geliştirir, ancak bu, casper embriyolarının üretilmesiyle aşılmıştır (RoyA9; MitfaW2), yaşam boyu saydam kalan13. Optik özellikleri nedeniyle, casper zebra balığı, nakledilen tümör hücrelerinin ideal alıcılarıdır 14,15,16. Tümör hücrelerinin zebra balığına ksenotransplantasyonu son 2 yılda önem kazanmıştır 17,18,19,20,21. Zebra balığı embriyoları doğuştan gelen bağışıklığa sahiptir; Bununla birlikte, larva evrelerinde adaptif bağışıklıktan yoksundurlar, bu da onları fonksiyonel olarak bağışıklığı baskılanmış hale getirir, bu da nakledilen tümör ksenogreftleri için etkili konakçılar olarak hizmet etmelerini sağlar22.
Zebra balığı embriyolarında ve bir dizi farklı değişkeni dikkate alan yetişkinlerde tümör aşılaması için protokoller geliştirilmiştir 23,24,25,26,27. Bunlar, yumurta sarısı, peri-vitellin boşluğu ve kalbe yapılan enjeksiyonlar dahil olmak üzere zebra balıklarında ve farklı gelişim aşamalarında çok sayıda tümör birikimi bölgesini araştırmıştır 16,28. Zebra balığı yetiştiriciliği tipik olarak 28 °C’de gerçekleşirken, memeli hücreleri 37 °C’de büyüdüğü için zebra balığı ksenogreftleri için su ürünleri yetiştiriciliğinin ortam sıcaklığı da önemlidir. Sonuç olarak, balık tarafından tolere edilen ancak tümör büyümesini destekleyen bir uzlaşma sıcaklığı kullanılmalıdır ve 34 ° C’nin her iki hedefe de ulaştığı görülmektedir29. Ksenotransplantasyonu takiben tümörlerin davranışının ve ilerlemesinin analizi bir diğer önemli odak alanıdır ve bu, sağkalım analizinin yanı sıra çeşitli görüntüleme modalitelerinin kullanımını içerir30. Zebra balığı modelinin en büyük avantajlarından biri, tümör davranışının in vivo çalışmalarına muazzam istatistiksel güç sağlamak için çok sayıda çalışma hayvanının mevcudiyetidir; Bununla birlikte, önceki yaklaşımlar, enjeksiyonlar için sıkıcı montaj prosedürlerinin gerekliliği nedeniyle bu potansiyeli ciddi şekilde sınırlamıştır.
Burada, şeffaf casper zebra balığı hattını kullanarak yüksek verim ve enjeksiyon kalitesinin izlenmesini sağlayan embriyoları evrelemek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirerek bu sınırlamayı ele alıyoruz. Bu, döllenmeden 2 gün sonra (dpf) casper zebra balığı embriyolarının yumurta sarısı kesesine ksenogreftlerin enjekte edilmesini gerektirir. Tümör davranış analizinin bir parçası olarak ksenotransplantasyonu takiben embriyoların sağkalımını gözlemliyoruz. Ayrıca, tek hücreli süspansiyonlar yaparak ve akış sitometrisi ile analiz ederek ksenotransplantasyon sonrası hastalık yükünün değerlendirmesini gösteriyoruz (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı ksenotransplantasyonu, fare çalışmalarına hızlı, sağlam ve uygun maliyetli bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır12. Zebra balığı ksenotransplantasyonuna yönelik çeşitli yaklaşımlar bildirilmiş olsa da, adaptasyonumuz önemli gelişmelerle sonuçlanmıştır. Prosedürle ilgili parametrelerin standartlaştırılmasına ek olarak, bu iyileştirmeler özellikle tümör enjeksiyonlarının gerçekleştirilme hızını hızlandırmaya odaklanmakta, böylece çalı?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Pennsylvania Topluluğu, Lösemi ve Lenfoma Derneği ve Piskopos Fonu’ndan bir ödenek olan NIH hibeleri R37AI110985 ve P30CA006927 tarafından desteklendi. Bu çalışma aynı zamanda Hücre Kültürü, Akış Sitometrisi ve Laboratuvar Hayvanı tesisi de dahil olmak üzere Fox Chase’deki temel tesisler tarafından desteklenmiştir. FCCC’deki zebra balığı ve mikroenjeksiyon tesisini koruduğu için Dr. Jennifer Rhodes’a teşekkür ederiz.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
