Denne protokollen beskriver en prosedyre for tredimensjonal (3D) utskrift av bakteriekolonier for å studere deres motilitet og vekst i komplekse 3D porøse hydrogelmatriser som ligner mer på deres naturlige habitater enn konvensjonelle flytende kulturer eller petriskåler.
Bakterier er allestedsnærværende i komplekse tredimensjonale (3D) porøse miljøer, som biologisk vev og geler, og underjord og sedimenter. Imidlertid har flertallet av tidligere arbeid fokusert på studier av celler i bulkvæsker eller på flate overflater, som ikke fullt ut rekapitulerer kompleksiteten til mange naturlige bakterielle habitater. Her adresseres dette kunnskapsgapet ved å beskrive utviklingen av en metode for å 3D-printe tette bakteriekolonier til fastkjørte granulære hydrogelmatriser. Disse matrisene har justerbare porestørrelser og mekaniske egenskaper; de begrenser cellene fysisk, og støtter dem dermed i 3D. De er optisk gjennomsiktige, noe som muliggjør direkte visualisering av bakteriell spredning gjennom omgivelsene ved hjelp av bildebehandling. Som et bevis på dette prinsippet, er evnen til denne protokollen demonstrert ved 3D-utskrift og avbildning av ikke-bevegelige og bevegelige Vibro cholerae, samt ikke-bevegelige Escherichia coli, i fastkjørte granulære hydrogelmatriser med varierende interstitielle porestørrelser.
Bakterier lever ofte i varierte, komplekse porøse 3D-miljøer som spenner fra slimhinnegeler i tarmen og lungene til jord i bakken 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. I disse innstillingene kan bakteriell bevegelse gjennom motilitet eller vekst hindres av omkringliggende hindringer, for eksempel polymernettverk eller pakninger av faste mineralkorn som påvirker cellens evne til å spre seg gjennom sine omgivelser26, få tilgang til næringskilder, kolonisere nytt terreng og danne beskyttende biofilmsamfunn27. Imidlertid bruker tradisjonelle laboratoriestudier vanligvis svært forenklede geometrier, med fokus på celler i flytende kulturer eller på flate overflater. Selv om disse tilnærmingene gir viktig innsikt i mikrobiologi, rekapitulerer de ikke fullt ut kompleksiteten til naturlige habitater, noe som fører til dramatiske forskjeller i vekstrater og motilitetsadferd sammenlignet med målinger utført i virkelige omgivelser. Derfor er det kritisk nødvendig med en metode for å definere bakteriekolonier og studere deres motilitet og vekst i 3D-porøse miljøer som er mer lik mange av deres naturlige habitater.
Inokulering av celler i en agargel og deretter visualisering av makroskopisk spredning med øye eller bruk av kamera gir en enkel måte å oppnå dette på, som først foreslått av Tittsler og Sandholzer i 193628. Denne tilnærmingen lider imidlertid av en rekke viktige tekniske utfordringer: (1) Mens porestørrelsene i prinsippet kan varieres ved å variere agarosekonsentrasjonen, er porestrukturen til slike geler dårlig definert; (2) Lysspredning fører til at disse gelene blir uklare, noe som gjør det vanskelig å visualisere celler på individuell skala med høy oppløsning og troskap, spesielt i store prøver; (3) Når agarkonsentrasjonen er for stor, er cellemigrasjon begrenset til den øverste flate overflaten av gelen; (4) Den komplekse reologien til slike geler gjør det utfordrende å introdusere inokula med veldefinerte geometrier.
For å løse disse begrensningene, i tidligere arbeid, utviklet Dattas laboratorium en alternativ tilnærming ved hjelp av granulære hydrogelmatriser – bestående av fastkjørte, biokompatible hydrogelpartikler hovne i flytende bakteriekultur – som “porøse petriskåler” for å begrense celler i 3D. Disse matrisene er myke, selvhelbredende, utbytte-stress faste stoffer; Således, i motsetning til med tverrbundne geler som brukes i andre bioprintingsprosesser, kan en injeksjonsmikrodyse bevege seg fritt inne i matrisen langs en hvilken som helst foreskrevet 3D-bane ved lokalt å omorganisere hydrogelpartiklene29. Disse partiklene kondenserer deretter raskt og selvhelbreder rundt injiserte bakterier, og støtter cellene på plass uten ytterligere skadelig behandling. Denne prosessen er derfor en form for 3D-printing som gjør det mulig å arrangere bakterieceller – i en ønsket 3D-struktur, med en definert samfunnssammensetning – innenfor en porøs matrise med justerbare fysisk-kjemiske egenskaper. Dessuten er hydrogelmatrisene helt gjennomsiktige, slik at cellene kan visualiseres direkte ved hjelp av avbildning.
Nytten av denne tilnærmingen har blitt demonstrert tidligere på to måter. I ett sett med studier ble fortynnede celler spredt gjennom hydrogelmatrisen, noe som muliggjorde studier av motiliteten til individuelle bakterier30,31. I et annet sett med studier ble multicellulære samfunn 3D-printet i centimeterskala geler ved hjelp av en injeksjonsdyse montert på et programmerbart mikroskopstadium, noe som muliggjorde studier av spredning av bakterielle kollektiver gjennom omgivelsene32,33. I begge tilfeller viste disse studiene tidligere ukjente forskjeller i spredningsegenskapene til bakterier som bor i porøse miljøer sammenlignet med de i flytende kultur / på flate overflater. Men gitt at de ble montert på et mikroskopstadium, var disse tidligere studiene begrenset til små prøvevolumer (~ 1 ml) og derfor korte eksperimentelle tidsskalaer. De var også begrenset i deres evne til å definere inokulageometrier med høy romlig oppløsning.
Her beskrives neste generasjon av denne eksperimentelle plattformen som adresserer begge begrensningene. Spesielt er protokoller gitt der man kan bruke en modifisert 3D-skriver med en festet sprøyteekstruder til 3D-utskrift og bilde bakteriekolonier i stor skala. Videre indikerer representative data hvordan denne tilnærmingen kan være nyttig for å studere motilitet og vekst av bakterier, ved hjelp av biofilm-tidligere Vibrio cholerae og planktoniske Escherichia coli som eksempler. Denne tilnærmingen gjør det mulig å opprettholde bakteriekolonier over lange tider og visualiseres ved hjelp av ulike bildebehandlingsteknikker. Derfor har evnen til denne tilnærmingen til å studere bakteriesamfunn i 3D-porøse habitater enorm forskning og anvendt potensial, som påvirker behandlingen og studiet av mikrober i tarmen, huden, lungen og jorda. Videre kan denne tilnærmingen brukes i fremtiden for 3D-utskrift av bakteriebaserte konstruerte levende materialer til mer komplekse frittstående former.
Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å sikre at matrisen er laget i et sterilt miljø når du forbereder hver hydrogelmatrise. Hvis ikke, kan forurensning oppstå, noe som manifesterer seg som for eksempel mikrokolonier (små sfæroider) i matrisen etter flere dager. Under blandingsprosessen er det viktig at alle tørre granulære hydrogelpartikler oppløses. I tillegg, når du justerer pH i hver hydrogelmatrise med NaOH, vil granulatene begynne å svulme, noe som øker viskositeten til hydrogelmatrisen, noe som fører til at blanding blir vanskeligere. Bruk av stativblanderen vil bidra til å sikre at NaOH blandes godt inn i hydrogelmatrisen. Under lasting av hver bakteriell suspensjon kan det dannes luftlommer i nålen. For å unngå dette problemet, sørg for at nålespissen alltid sitter i bakteriesuspensjonen i sentrifugerøret og ikke i bunnen av røret eller nær toppoverflaten. En annen måte å overvinne dette problemet på er å vokse store mengder celler og dermed ha større volumer av bakteriesuspensjonen for utskrift.
Begrensninger
For tiden, under utskrift, begrenser den lave viskositeten til bakteriell suspensjon geometriene som kan skrives ut og fører ofte til at en biofilm dannes og vokser på toppen av hydrogelmatriseoverflaten på grunn av sporceller. Det er noen potensielle metoder for å overvinne denne begrensningen, inkludert å øke viskositeten til bakteriesuspensjonen eller optimalisere 3D-skriverinnstillingene ytterligere. For å øke viskositeten til bakteriesuspensjonen kan man blande bakteriesuspensjonen med en annen polymer – for eksempel alginat, som tidligere har blitt brukt til 3D-printing av bakterier på flate overflater38. Skriverinnstillingene kan optimaliseres ytterligere for å muliggjøre tilbaketrekking av sprøytestempelet under uttak av nålen fra den granulære hydrogelmatriksen, noe som vil ha potensial til å stoppe celler fra å bli avsatt under fjerning av nålen fra hydrogelmatriksen.
Metodens betydning for eksisterende/alternative metoder
Metoden beskrevet her tillater utskrift av bakteriekolonier i granulære hydrogelmatriser. De granulære hydrogelmatrisene tillater studier av virkningen av eksterne miljøfaktorer (f.eks. Porestørrelse, matrisedeformbarhet) på motiliteten og veksten av bakterier. I tillegg, mens LB i dette arbeidet brukes som flytende vekstmedium for å svulme hydrogelmatrisen, kan hydrogelmatrisen bli hovent med andre flytende vekstmedier, inkludert medier med antibiotika. Tidligere metoder for å studere bakterier i begrensede miljøer var begrenset av lengden på eksperimentell tid, polymermaskestørrelsen og omkringliggende hydrogelmatriksstivhet37,38. Protokoller eksisterer allerede for å lage granulære hydrogelmatriser ut av forskjellige polymerer, så potensialet for å studere virkningen av forskjellige miljøforhold på motilitet og vekst av bakterier er stort. Denne metoden tillater studier av bakterier i kontrollmiljøer som lettere rekapitulerer miljøene som bakterier bor i den virkelige verden, for eksempel vertsslim eller jord. En annen begrensning av mange andre metoder er opasiteten til den omkringliggende matrisen; Imidlertid gir denne tilnærmingen ved hjelp av optisk gjennomsiktige materialer muligheten til å utforske, for eksempel optogenetisk kontroll og mønstre av bakterier i 3D.
Utover å studere motilitet og vekst, overvinner 3D-utskriftsmetoden beskrevet her begrensningen av mange andre bioprintingsmetoder som krever avsetning av et bioblekk på et substrat og er derfor begrenset i høyden av det konstruerte levende materialet de kan produsere. I fremtiden kan denne bioprintingsprotokollen utvides ytterligere for å fremstille biohybridmaterialer ved å blande polymerer med biofilmdannende celler. De granulære hydrogelmatrisene gir støtte for 3D-utskrift tykkere, større konstruerte levende materialer og mer komplekse geometrier enn mange andre nåværende bakteriebioprintingsmetoder. Mens dette arbeidet bare brukte V. cholerae og E. coli, har andre arter, som Pseudomonas aeruginosa, også blitt 3D-printet37. Utover utskrift kan skriveren tilpasses til å gjøre en kontrollert prøvetaking av bakterier etter vekst for å se om det har skjedd noen genetiske endringer, for eksempel.
The authors have nothing to disclose.
RKB anerkjenner støtte fra Presidential Postdoctoral Research Fellows Program. Dette materialet er også basert på arbeid støttet av NSF Graduate Research Fellowship Program Grant DGE-2039656 (til AMH). ASD-M. og HNL anerkjenner støtte fra Lidow Independent Work / Senior Thesis Fund ved Princeton University. Vi takker også laboratoriet til Bonnie Bassler for å gi stammer av V. cholerae. SSD anerkjenner støtte fra NSF Grants CBET-1941716, DMR-2011750 og EF-2124863, samt Eric og Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, New Jersey Health Foundation, Pew Biomedical Scholars Program og Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.
1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 |
|
15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope |
|
Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791 |
Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |