Summary

3D-utskriftsbakterier for å studere motilitet og vekst i komplekse 3D-porøse medier

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver en prosedyre for tredimensjonal (3D) utskrift av bakteriekolonier for å studere deres motilitet og vekst i komplekse 3D porøse hydrogelmatriser som ligner mer på deres naturlige habitater enn konvensjonelle flytende kulturer eller petriskåler.

Abstract

Bakterier er allestedsnærværende i komplekse tredimensjonale (3D) porøse miljøer, som biologisk vev og geler, og underjord og sedimenter. Imidlertid har flertallet av tidligere arbeid fokusert på studier av celler i bulkvæsker eller på flate overflater, som ikke fullt ut rekapitulerer kompleksiteten til mange naturlige bakterielle habitater. Her adresseres dette kunnskapsgapet ved å beskrive utviklingen av en metode for å 3D-printe tette bakteriekolonier til fastkjørte granulære hydrogelmatriser. Disse matrisene har justerbare porestørrelser og mekaniske egenskaper; de begrenser cellene fysisk, og støtter dem dermed i 3D. De er optisk gjennomsiktige, noe som muliggjør direkte visualisering av bakteriell spredning gjennom omgivelsene ved hjelp av bildebehandling. Som et bevis på dette prinsippet, er evnen til denne protokollen demonstrert ved 3D-utskrift og avbildning av ikke-bevegelige og bevegelige Vibro cholerae, samt ikke-bevegelige Escherichia coli, i fastkjørte granulære hydrogelmatriser med varierende interstitielle porestørrelser.

Introduction

Bakterier lever ofte i varierte, komplekse porøse 3D-miljøer som spenner fra slimhinnegeler i tarmen og lungene til jord i bakken 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. I disse innstillingene kan bakteriell bevegelse gjennom motilitet eller vekst hindres av omkringliggende hindringer, for eksempel polymernettverk eller pakninger av faste mineralkorn som påvirker cellens evne til å spre seg gjennom sine omgivelser26, få tilgang til næringskilder, kolonisere nytt terreng og danne beskyttende biofilmsamfunn27. Imidlertid bruker tradisjonelle laboratoriestudier vanligvis svært forenklede geometrier, med fokus på celler i flytende kulturer eller på flate overflater. Selv om disse tilnærmingene gir viktig innsikt i mikrobiologi, rekapitulerer de ikke fullt ut kompleksiteten til naturlige habitater, noe som fører til dramatiske forskjeller i vekstrater og motilitetsadferd sammenlignet med målinger utført i virkelige omgivelser. Derfor er det kritisk nødvendig med en metode for å definere bakteriekolonier og studere deres motilitet og vekst i 3D-porøse miljøer som er mer lik mange av deres naturlige habitater.

Inokulering av celler i en agargel og deretter visualisering av makroskopisk spredning med øye eller bruk av kamera gir en enkel måte å oppnå dette på, som først foreslått av Tittsler og Sandholzer i 193628. Denne tilnærmingen lider imidlertid av en rekke viktige tekniske utfordringer: (1) Mens porestørrelsene i prinsippet kan varieres ved å variere agarosekonsentrasjonen, er porestrukturen til slike geler dårlig definert; (2) Lysspredning fører til at disse gelene blir uklare, noe som gjør det vanskelig å visualisere celler på individuell skala med høy oppløsning og troskap, spesielt i store prøver; (3) Når agarkonsentrasjonen er for stor, er cellemigrasjon begrenset til den øverste flate overflaten av gelen; (4) Den komplekse reologien til slike geler gjør det utfordrende å introdusere inokula med veldefinerte geometrier.

For å løse disse begrensningene, i tidligere arbeid, utviklet Dattas laboratorium en alternativ tilnærming ved hjelp av granulære hydrogelmatriser – bestående av fastkjørte, biokompatible hydrogelpartikler hovne i flytende bakteriekultur – som “porøse petriskåler” for å begrense celler i 3D. Disse matrisene er myke, selvhelbredende, utbytte-stress faste stoffer; Således, i motsetning til med tverrbundne geler som brukes i andre bioprintingsprosesser, kan en injeksjonsmikrodyse bevege seg fritt inne i matrisen langs en hvilken som helst foreskrevet 3D-bane ved lokalt å omorganisere hydrogelpartiklene29. Disse partiklene kondenserer deretter raskt og selvhelbreder rundt injiserte bakterier, og støtter cellene på plass uten ytterligere skadelig behandling. Denne prosessen er derfor en form for 3D-printing som gjør det mulig å arrangere bakterieceller – i en ønsket 3D-struktur, med en definert samfunnssammensetning – innenfor en porøs matrise med justerbare fysisk-kjemiske egenskaper. Dessuten er hydrogelmatrisene helt gjennomsiktige, slik at cellene kan visualiseres direkte ved hjelp av avbildning.

Nytten av denne tilnærmingen har blitt demonstrert tidligere på to måter. I ett sett med studier ble fortynnede celler spredt gjennom hydrogelmatrisen, noe som muliggjorde studier av motiliteten til individuelle bakterier30,31. I et annet sett med studier ble multicellulære samfunn 3D-printet i centimeterskala geler ved hjelp av en injeksjonsdyse montert på et programmerbart mikroskopstadium, noe som muliggjorde studier av spredning av bakterielle kollektiver gjennom omgivelsene32,33. I begge tilfeller viste disse studiene tidligere ukjente forskjeller i spredningsegenskapene til bakterier som bor i porøse miljøer sammenlignet med de i flytende kultur / på flate overflater. Men gitt at de ble montert på et mikroskopstadium, var disse tidligere studiene begrenset til små prøvevolumer (~ 1 ml) og derfor korte eksperimentelle tidsskalaer. De var også begrenset i deres evne til å definere inokulageometrier med høy romlig oppløsning.

Her beskrives neste generasjon av denne eksperimentelle plattformen som adresserer begge begrensningene. Spesielt er protokoller gitt der man kan bruke en modifisert 3D-skriver med en festet sprøyteekstruder til 3D-utskrift og bilde bakteriekolonier i stor skala. Videre indikerer representative data hvordan denne tilnærmingen kan være nyttig for å studere motilitet og vekst av bakterier, ved hjelp av biofilm-tidligere Vibrio cholerae og planktoniske Escherichia coli som eksempler. Denne tilnærmingen gjør det mulig å opprettholde bakteriekolonier over lange tider og visualiseres ved hjelp av ulike bildebehandlingsteknikker. Derfor har evnen til denne tilnærmingen til å studere bakteriesamfunn i 3D-porøse habitater enorm forskning og anvendt potensial, som påvirker behandlingen og studiet av mikrober i tarmen, huden, lungen og jorda. Videre kan denne tilnærmingen brukes i fremtiden for 3D-utskrift av bakteriebaserte konstruerte levende materialer til mer komplekse frittstående former.

Protocol

Denne tilnærmingen er å konvertere en kommersiell 3D-smeltet avsetningsmodelleringsskriver til en 3D-bioprinter ved hjelp av en tidligere etablert protokoll av Tashman et al.34. Kort fortalt erstattet Tashman et al. et kommersielt ekstruderhode med en spesiallaget sprøytepumpeekstruder. Denne ekstruderen muliggjør utskrift av høykonsentrerte flytende suspensjoner av bakterieceller i 3D, med ekstrudert volum og 3D-posisjon styrt av programmeringsspråket G-kode. Det ekstruderte volumet spesifiseres i programvaren ved ekstrudertrinnet (E-trinn) og kalibreres i tillegg som beskrevet nærmere nedenfor. Disse bakterielle suspensjonene skrives dermed direkte inn i en granulær hydrogelmatrise, som fungerer som en 3D-støtte for cellene. Nedenfor beskriver protokollen også hvordan man fremstiller matriser med forskjellige polymerkonsentrasjoner, karakteriserer de resulterende endringene i porestørrelse og reologiske egenskaper, og karakteriserer påfølgende bakteriell motilitet og vekst ved hjelp av direkte avbildning. 1. Konvertering av en kommersiell 3D-skriver til en 3D-bioprinter Fjern ekstruderen og ovnen fra en kommersiell 3D-skriver (se Materialfortegnelse). Følg tidligere protokoller for å fremstille sprøytepumpens ekstruder34, med en ekstra modifikasjon for å imøtekomme en engangs Luer-låssprøyte. Monter sprøytepumpeekstruderen på skriveren.MERK: CAD-filene som kreves for å modifisere sprøytepumpeekstruderen for plastsprøyter, finnes i tilleggsfiler 1-3. Installer og åpne 3D-skriverprogramvaren (se Materialfortegnelse) på en datamaskin. Koble 3D-skriveren til datamaskinen. Legg en 1 ml engangssprøyte med en kanyle av passende størrelse inn i de 3D-printede klemmene ved å justere øvre og nedre halvdel av mekanismen (figur 1). Fest klemmene rundt sprøyten med tre M8-sokkelbolter og sekskantmuttere i tynt stål (se Materialfortegnelse). Sprøytestempelet kobles til blyskruen i sprøytepumpens ekstruder. Løft stempelet manuelt ved å dreie blyskruen for å skape en 0,5 ml luftspalte i sprøyten. Hvis forurensning er en bekymring for forsøket, transporter sprøyteklemmekomplekset til en biohood og steriliser med 70% etanolspray ved inngang før du fullfører følgende trinn. 2. Tilberedning av bakteriell suspensjon For V. cholerae og E. coli, vokse over natten på en 2% Lennox LB (Luria Buljong, se Tabell over materialer) agar plate ved 37 ° C.For V. cholerae, inokuler cellene i 3 ml flytende LB med ti sterile glassperler. Dyrk cellene i en ristende inkubator ved 37 ° C i 5-6 timer til den midt-eksponentielle fasen til en optisk tetthet (OD) 600 på ~ 0,9. For E. coli, inokuler cellene i 3 ml flytende LB. Dyrk cellene i en ristende inkubator ved 37 ° C over natten. Innokuler 200 μL av overnattingskulturen i fersk LB i 3 timer til OD når 0,6. Overfør kulturen til et 10 ml sentrifugerør. Sentrifuger kulturen i 5 minutter ved 5000 x g ved romtemperatur for å danne en pellet. Fjern supernatanten. Resuspender med ~ 10 μL flytende LB for å oppnå en celletetthet på ~ 9 x 1010 celler per ml. 3. Legg bakteriemiksturen i sprøyten MERK: Det finnes to metoder for å legge bakteriene i sprøyten (trinn 3.1 og trinn 3.2). Trinn 3.1 fungerer for lasting av små volumer bakterielle suspensjoner, 200 μL. Trinn 3.1 ble benyttet for de representative resultatene vist her. Legg en tom 1 ml plast Luer låsesprøyte inn i 3D bioprinteren. Koble sprøytestempelet med blyskruen. Trekk sprøyten manuelt inn for å legge til 0,2 ml av luftspalten for å gi plass til at stempelet kan bevege seg i sprøyten, da et lite volum celler ~20-50 μL brukes til hver gruppe eksperimenter.Fest en butt kanyle til sprøytespissen med den kanylestørrelsen som er nødvendig for den størrelsen på utskriftsfunksjonene som kreves. Her brukes en 2-tommers 20 G nål. Legg bakteriemiksturen i sprøyten ved å plassere et 10 ml sentrifugerør med bakteriell inokulum under nålen. Drei skruen manuelt for å trekke sprøytestempelet inn og legg cellene i sprøyten. Bakteriecellevolumene er så små at cellene ofte bare lastes inn i nålen. Fjern stempelet fra sprøyteklemmekomplekset og bruk en annen sprøyte og nål til å forsiktig laste sprøyteklemmekomplekset med de ønskede bakterielle suspensjonene, og vær forsiktig så du ikke fanger luftbobler. Sprøyteklemmekomplekset skal fylles litt over randen med ønsket bakteriell suspensjon og deretter overføres til bioprinteren.Sett sprøyteklemmekomplekset forsiktig uten stempelet inn i den tilsvarende kontakten på hovedkjernen til bioskriverekstruderen. Forsikre deg om at skrivervognen er omtrent halvveis opp i blyskruen, og at det finnes en oppsamlingsfat under den fylte sprøyten. Sett deretter stempelet forsiktig gjennom både vognen og sprøyteklemmekomplekset til det fanger vognen. Press stempelet sakte inn i bakteriesuspensjonen for å unngå at luftbobler fanges opp i sprøyten. Skyv adapterklemmen på vognen over baksiden av stempelet for å feste den på plass for både ekstruderings- og tilbaketrekkingsmanøvrer. 4. Kalibrering av ekstrudertrinnet til avsatt volum For å kalibrere ekstrudertrinnet (E-trinnet) til det deponerte volumet, må du først sette opp bioskriveren med den nøyaktige sprøyten, sprøytenålen og deponere bakteriell suspensjon som skal brukes i forsøket. Her brukes en 1 ml Luer låsesprøyte. Bestem et estimert E-trinnområde som skal kalibreres over ved å ekstrudere et vilkårlig E-trinnnummer (~200) og noter stempelvolumendringen med sprøytevolummarkører. Bruk dette grove forholdet mellom E-trinn og volum til å bestemme E-trinninnstillingene for å utføre kalibreringssveipingen over. For eksempel, hvis et E-trinn på 200 ekstruderer ca. 20 μL ved visuell inspeksjon og man ønsker å deponere 10-200 μL, test E-trinn mellom 100-2000. For å utføre den lineære kalibreringsfeiingen, må du først merke og måle tørrmassen til tjue 1,5 ml prøvetakingsrør på en analytisk vekt med 0,1 mg følsomhet. Ekstruder bakteriell suspensjon i de forhåndsmålte 1,5 ml rørene. For hvert E-trinn utfører du minst 2 replikater. Gjenta for alle E-trinn over det lineære området, og erstatt bakteriesuspensjonen etter behov. Hvis forurensning er en bekymring for forsøket, tørk utsiden av sprøytenålen med en lofri våtserviett mettet med 70% etanol etter hver prøve. Mål massen til alle 1,5 ml rør med samme analytiske balanse. Trekk den første masseverdien fra den andre for å oppnå en nettomasse bakteriell suspensjon deponert. Konverter massen av bakteriell suspensjon til et volum med materialets tetthet. For mange bakteriesuspensjoner som hovedsakelig består av vann, er 1 g/ml en passende tetthetstilnærming. Utfør en lineær tilpasning mellom E-trinnet og det ekstruderte volumet for å fullføre kalibreringsprosessen. 5. Fremstilling av den granulære hydrogelmatrisen I et biosikkerhetsskap, tilsett tørre granulater av tverrbundne akrylsyre / alkylakrylatkopolymerer (se materialtabell) til 400 ml 2% Lennox Luria-Bertani (LB) for å holde matrisen steril; Imidlertid kan andre flytende cellekulturmedier også brukes til å svelle hydrogelmatrisen.MERK: Vektprosenten av granulat tilsatt LB avhenger av porestørrelsen som man sikter mot. I denne studien, for en 0,9% granulær hydrogelmatrise, tilsettes 3,6 g tørre granulater til LB og for en 1,2% granulær hydrogelmatrise tilsettes 4,8 g tørre granulater til LB. Hydrogelgranulatene dispergeres homogent ved å blande dem i en stativblander i 2 minutter. Når den er blandet, juster pH til 7,4 ved å tilsette trinn på 20 til 500 μL med 10 M natriumhydroksid (NaOH) for å sikre cellens levedyktighet. Etter hver tilsetning av NaOH, måle pH ved å dyppe en pipettespiss i blandingen og deretter tørke hydrogelmatrisen på et pH-testpapir.MERK: Når NaOH tilsettes, vil viskositeten til blandingen øke etter hvert som hydrogelgranulatene begynner å svulme. De hovne hydrogelgranulatene er ~ 5 μm til 10 μm i diameter og fastkjørt sammen i en hydrogelmatrise. Den indre maskestørrelsen på granulatene er ~ 40 nm til 100 nm, som tidligere etablert32. Maskestørrelsen er stor nok til at små molekyler (f.eks. oksygen og næringsstoffer) kan diffundere fritt, men liten nok til at bakterier kan begrenses mellom de interstitielle porene. Deretter overfører du den granulære hydrogelmatrisen til et 50 ml sentrifugerør ved hjelp av en 50 ml steril plastsprøyte. Sentrifuger hydrogelmatrisen ved 161 x g i 1 min ved romtemperatur for å fjerne boblene som dannes under blandingsprosessen. La hydrogelmatrisen sitte i minst 2 dager ved romtemperatur for å sikre at ingen forurensning har oppstått. Forurensningen fremstår som mikrokolonier suspendert i hydrogelmatrisen. Etter to dager, sentrifuge hydrogelmatrisen ved 161 x g i 1 min for å fjerne eventuelle ekstra bobler som dannes.MERK: Protokollen kan settes på pause her ved å lagre hydrogelmatrisen ved romtemperatur i opptil en uke. I biosikkerhetsskapet, ved hjelp av en 30 ml steril plastsprøyte, overfør ønsket mengde hydrogelmatrise til beholderen der utskrift vil skje (her ble ~ 20 ml for en 20 ml vevskulturkolbe eller 1 ml for 1 ml plastmikrokyvetter brukt). 6. Karakterisering av granulære hydrogelmatriksreologiske egenskaper Load ~ 3 ml av hydrogelmatrisen i et skjærreometer (se materialtabellen) med et 1 mm gap mellom grove 50 mm diameter parallelle plater for å måle de reologiske egenskapene. Kvantifiser flyteegenskapene ved hjelp av ensrettede skjærmålinger på skjærreometeret ved å måle skjærspenningen som en funksjon av et logaritmisk sveip av skjærhastighet fra 10-4 s-1 til 102 s-1 ( f.eks. figur 2A).MERK: Ved lave skjærhastigheter vil hydrogelmatrisen ha en konstant skjærspenning (flytespenningen) som er uavhengig av skjærhastigheten. Ved høye skjærhastigheter vil skjærspenningen øke med en kraftlovavhengighet av skjærhastigheten, noe som indikerer fluidiseringen av hydrogelmatrisen. Denne flytespenningen gjør at bakterier kan 3D-printes i den granulære hydrogelmatrisen29. Mål lagrings- og tapsmodulen, henholdsvis G ‘ og G” , som en funksjon av frekvens ved hjelp av liten amplitude oscillerende reologi med en belastningsamplitude på 1% og frekvenser mellom 0,1 til 1 Hz (f.eks. figur 2B).MERK: Den ideelle granulære hydrogelmatrisen for 3D-utskrift bør ha en lagringsmodul større enn tapsmodulen, noe som indikerer at mediet fungerer som et fastkjørt elastisk faststoff 29. 7. Karakterisering av den granulære hydrogelmatrisen interstitiell porestørrelse Sonikere 100 nm karboksylerte fluorescerende polystyren nanopartikler (~ 3,6 x 1013 partikler / ml, se materialtabell) i emballasjen i 15 minutter for å resuspendere for å bryte opp eventuelle aggregeringer / klynger av partikler. Overfør 50 μL nanopartikler til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.Sentrifuge i 10 minutter ved 9 500 x g ved romtemperatur til pelleten dannes og supernatanten er klar. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml av væskevekstmediet (her LB) som brukes til å fremstille den granulære hydrogelmatriksen.MERK: Protokollen kan settes på pause her ved å lagre de resuspenderte nanopartiklene ved 4 °C i opptil 3 måneder. Sonikere de resuspenderte nanopartiklene i 30 minutter. Overfør 1 ml granulær hydrogelmatriks til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 1 μL av de resuspenderte nanopartiklene til den granulære hydrogelmatrisen og bland dem med en pipettespiss. Etter blanding, sentrifuge i 30 s ved 161 x g ved romtemperatur. Overfør hydrogelmatrisen og nanopartikkelblandingen til en 35 mm diameter petriskål med en 0,1 mm tykk glassbunnbrønn. Brønnen er 20 mm i diameter og 1 mm i dybden. Plasser et glassdeksel på toppen og trykk ned for å deaktivere strømning og fordampning under avbildning. Et alternativ til glassdekselet er å tilsette 1 ml parafinolje på toppen. Bilde nanopartiklene ved hjelp av et konfokalmikroskop med et 40x oljemål med 8x ekstra zoom i bildebehandlingsprogramvaren (se materialfortegnelse).MERK: Et høyere forstørrelsesmål kan brukes i stedet for å bruke ekstra digital zoom i programvaren.Avbilde en tidssløyfe uten forsinkelse (ideelt ~19 bilder/s) i et enkelt z-plan i 2 minutter med minst fire nanopartikler innenfor synsfeltet. Gjenta 15 til 20 ganger på forskjellige steder for å samle nok data til statistikk (100 til 200 nanopartikler). Bruk en partikkelsporingsprogramvare for å analysere forskyvningen av partiklene. Her brukes et spesialskrevet skript basert på den klassiske Crocker-Grier-algoritmen for å spore massesenteret til nanopartikkelen35 (se tilleggsfil 7).Fra partikkelsporingen beregner du gjennomsnittlig kvadratforskyvning (MSD). MSD vil vise fri diffusjon i porerommet ved korte lengder og tidsskalaer og overgang til subdiffusiv skalering ved store lengder og tidsskalaer på grunn av innesperring35. Identifiser lengdeskalaen der overgangen til subdiffusiv skalering skjer for å estimere den lokale porestørrelsen. Beregn porestørrelse ved å legge denne lengdeskalaen til nanopartikkeldiameteren. Gjenta porestørrelsesanalysen for hver nanopartikkel som måles. Dette vil gi en porestørrelsesfordeling som en gjennomsnittlig porestørrelse kan beregnes ut fra (f.eks. figur 3). 8. 3D utskriftsprosess 3D-print skreddersydde holdere for prøvebeholderne (se tilleggsfiler 4-6 for CAD-filene ). Her brukes holdere for vevskulturflasker og mikrokuvetter. Holderne gjør det mulig å programmere skriveren til å skrive ut flere prøver i en enkelt utskriftsøkt. Plasser prøvebeholderne med hydrogelmedier i holderne på byggeplattformen. Åpne programvaren for 3D-utskrift. Last inn en forhåndsprogrammert g-kode i programvaren. For de representative resultatene brukes trinn 3.1 til å laste bakteriesuspensjonen inn i 3D-skriveren.MERK: Et eksempel på en g-kode for utskrift av lineære vertikale geometrier er gitt i tabell 1. Gjennom 3D-utskriftsprogramvaren flytter du x-y-z-flyene for å sentrere skrivehodet på x-y-planet for å være den første beholderen og deretter hjem z-aksen. Den homing z-aksen vil heve skrivehodet. Roter skruen manuelt sakte for å trykke inn sprøytestempelet til en liten del av bakteriesuspensjonen kan ses på kanylespissen.Tørk lett av overflødig bakteriell suspensjon med en steril engangsserviett. Basert på høyden på prøveholderen, nålen og sprøyten, senk skrivehodet en fast avstand inn i hydrogelmediet i prøvebeholderen ved hjelp av 3D-utskriftsprogramvaren. Start utskriftsprosessen ved å klikke på Skriv ut. Når utskriften er fullført, lukker du prøvebeholderne. Tørk av skriveren med 70 % etanol. Kast sprøyten og kanylen på riktig måte. 9. Dyrking og avbildning av V. cholerae For store synsfeltbilder, bruk et kamera med zoomobjektivfeste til bildecellevekst med en lysboks. Bilde prøvene rett etter utskrift ved romtemperatur og overfør dem deretter til en inkubator. Opprettholde prøver ved 37 °C i en stasjonær inkubator mellom bildebehandlingsøkter under forsøket. Ta bilder over ønsket tid for å observere vekstoppførselen i lange perioder i den granulære hydrogelmatrisen.

Representative Results

Ved hjelp av en 3D-bioprinter med den granulære hydrogelmatrisen utvides bioprinternes muligheter til å skrive ut bakteriekolonier i former som, når de skrives ut på et flatt substrat i stedet, vil falle på grunn av den lave viskositeten til bakteriesuspensjonen. Oppløsningen av tilnærmingen som presenteres her, avhenger av ekstruderingshastigheten, nålens størrelse, skrivehodets hastighet, luft i nålen og viskositeten til bakteriell suspensjon. På grunn av det lave volumet av bakteriell suspensjon kan luftbobler utilsiktet introduseres under lasting av bakteriemiksturen i sprøyten og kanylen. Dette kan føre til at det avsettes en luftboble i den endelige trykte strukturen (figur 4). En annen måte å få luftbobler inn i trykket på, er hvis man ikke trykker inn stempelet for å danne en liten dråpe bakteriell suspensjon på spissen av nålen før utskrift, og det er et luftgap på spissen av nålen. Hvis du ikke trykker ned sprøytestempelet før utskrift, kan det også føre til at forskjellige volumer av celler skrives ut i samme batch. Men etter hvert som tiden går, løses luftboblen opp i det omkringliggende mediet, som vist i figur 4. For kalibrering av ekstruderingstrinnet er det avsatte volumet avhengig av hvordan den lineære aktuatoren til skrivehodet oversetter sprøytestempelet, sprøytens indre diameter vil påvirke volumet direkte. Videre vil de reologiske egenskapene til bakteriell suspensjon påvirke hvor lett de skjærer gjennom nålkontraksjonen for å skrive ut jevnt. Denne kalibreringsprosedyren bør derfor gjøres om for hvert oppsett av sprøyte/nål/bakteriell suspensjon. I prinsippet kan sprøytekalibrering automatiseres. I praksis vil det imidlertid være utfordrende å skrive en slik kode som i stor grad gjelder for mange brukstilfeller. For eksempel vil en bruker som har som mål å kalibrere ekstruderingen av ca. 300 μL fra en 1 ml sprøyte, måtte fylle sprøyten på nytt mye oftere enn en bruker som kalibrerer rundt et målvolum på 30 μL. Siden E-trinn-til-volumkalibreringskonstanten er ukjent når kalibreringsprosessen begynner, kan det hende at brukeren ikke kan forutsi nøyaktig hvor ofte omlasting faktisk er nødvendig. Videre, for å automatisere kalibreringsprosessen, må de nøyaktige posisjonene til hvert forhåndsveid 1,5 ml rør spesifiseres. For å sikre at alt bioblekket avsettes fra nålen inn i røret for nøyaktig kalibrering, må det oppnås nøyaktig kontakt mellom nålen og rørets bunn/vegg. Uten god kontakt kan små dråper forbli fuktet og festet til nålen. Dermed kan enhver posisjonsvariasjon mellom rør i stor grad bidra til feil i kalibreringsprosessen. Av disse grunnene anbefaler forfatterne at hver bruker bygger et kalibreringsprogram som passer deres unike behov. Et sentralt trekk ved tilnærmingen som presenteres her er evnen til å visualisere bakterier som sprer seg gjennom sine omgivelser direkte via motilitet og vekst ved hjelp av bildebehandling. I en tidligere versjon av protokollen for avbildning ble 6-brønnsplater fylt med 19 ml av en granulær hydrogelmatrise. Men selv med en vellykket 3D-utskrift av en horisontal linje med celler som kunne observeres på et omvendt mikroskop, ville en tett koloni også vokse på den øverste overflaten av mediet, noe som begrenser visualisering med lysfeltmikroskopi (figur 5). Kolonien på den øverste overflaten skyldes sannsynligvis forurensning da sprøytenålen ble plassert i eller fjernet fra mediet under utskrift. For å omgå dette problemet skrives vertikale linjer med celler ut i scintillasjonshetteglass (figur 6A). Krumningen av de sylindriske hetteglassene forårsaket imidlertid forvrengning under avbildning. Dette førte til valg av flatveggede kyvetter og vevskulturflasker som prøvebeholdere for utskrift, noe som muliggjorde uforvrengt avbildning (figur 6B-D). En begrensning av vevskulturflasker er den lille vippede halsen som begrenser geometriene som kan skrives ut. Samlet sett tillater denne protokollen observasjon av bakteriell motilitet og vekst i komplekse porøse miljøer over lange tidsskalaer. Noen eksempler er vist i figur 6B-G for biofilmdannende V. cholerae ved bruk av lysfeltmikroskopi samt planktoniske celler av E. coli ved bruk av laserskanningsfluorescens konfokal mikroskopi, noe som demonstrerer allsidigheten til denne tilnærmingen. Faktisk er et potensielt problem med hydrogelmatriser deres mulige autofluorescens når de avbildes ved hjelp av fluorescensmikroskopi; Bildene vist i figur 6F,G viser imidlertid at slik autofluorescens er minimal i den eksperimentelle plattformen som presenteres her. En annen begrensning av slike optiske mikroskopitilnærminger er deres romlige oppløsning, som er satt av diffraksjonsgrensen ved ~ 100 s nanometer; Imidlertid er denne lengdeskalaen mye mindre enn størrelsen på en individuell bakteriell celle, og derfor gir optiske teknikker muligheten til å avbilde bakterieceller fra skalaen til individuelle celler (figur 6G) til skalaen av større, multicellulære kolonier 30,31,32,33. Ytterligere eksempler er beskrevet nedenfor. Som nevnt ovenfor kan tilnærmingen som presenteres her brukes til å 3D-printe og avbilde bakteriekolonier i små (1 ml) og store (20 ml) matrisevolumer. Derfor er forskjellene i resultatene oppnådd ved bruk av forskjellige volumer beskrevet nedenfor, ved bruk av 3D-trykte kolonier av motile og ikke-bevegelige V. cholerae som representative eksempler. Den romlige oppløsningen (bredden på linjen) på utskriften settes av dysens indre diameter. I eksemplene beskrevet nedenfor resulterer en nål med en indre diameter på 0,6 mm i en innledende sylindrisk koloni på 0,6 mm. Tidligere arbeid har vist at utskriftsoppløsningen kan reduseres ytterligere ved å bruke en trukket glasskapillær med en indre diameter på ~ 100-200 μm33. For de små volumene brukes to forskjellige granulære hydrogelmatriser med to forskjellige porestørrelsesfordelinger: en med en gjennomsnittlig porestørrelse større enn den gjennomsnittlige diameteren til en V. cholerae-celle , 0,2-0,4 μm36, og den andre med en gjennomsnittlig porestørrelse mindre enn denne diameteren. Prøvene over tolv dager avbildes og måles gjennom bildeanalyse av kolonienes arealutvidelse over tid (figur 7 og figur 8). For ikke-bevegelige celler, som bare kan spre seg gjennom omgivelsene gjennom cellulær vekst, var utvidelseshastigheten lik mellom de forskjellige matrisene som ble undersøkt (figur 7), noe som indikerer at forskjeller i matriksporestørrelse ikke påvirker cellulær spredning gjennom vekst – som forventet. I kontrast, for de motile cellene som sprer seg gjennom omgivelsene gjennom aktiv motilitet, var utvidelseshastigheten for V. cholerae høyere for hydrogelmatrisen med de større porene – for hvilken inneslutning av hydrogelkornene hindrer cellulær motilitet mindre. Disse forskjellene i bakteriespredning var også tydelige i kolonimorfologiene (figur 8). Kolonien av V. cholerae i hydrogelmatriser med større porer spres gjennom glatte, diffuse søyler (figur 8A), som reflekterer spredning gjennom aktiv motilitet som tidligere observert32. Faktisk, i samsvar med denne tolkningen, observeres ikke disse diffuse søylene når det gjelder ikke-bevegelige celler (figur 8C). I tillegg er porene tilstrekkelig store til at cellene ikke skyver perlene når de svømmer gjennom porene. Videre er den viskøse spenningen som påføres ved svømming mindre enn 1 Pa, noe som ikke er tilstrekkelig til å deformere den omkringliggende hydrogelmatrisen betydelig. I motsetning til dette sprer kolonien i hydrogelmatriser med mindre porer bare gjennom grove, fraktallignende plumes for både motile og ikke-bevegelige celler (figur 8B, D), som reflekterer spredning utelukkende gjennom cellulær vekst, mens cellene vokser de deformerer forbigående og gir den omkringliggende matrisen. Faktisk, gitt at flytespenningen til hydrogelmatrisene er mye mindre enn turgortrykket til cellene, i denne grensen for liten porestørrelse, gir matrisen bare svak motstand mot cellulær vekst og ser ikke ut til å påvirke den 3D-trykte strukturen sterkt, også som bekreftet i vårt tidligere arbeid37. Lignende resultater observeres for eksperimenter utført i store volumprøver; Men gitt større overflod av næringsstoffer i disse prøvene, kunne forsøkene opprettholde cellulær vekst over lengre tidsskalaer. Som et eksempel vises resultater ved bruk av granulære hydrogelmatriser der gjennomsnittlig porestørrelse var mindre enn cellestørrelsen – og dermed var cellulær spredning hovedsakelig på grunn av vekst. Prøvene er avbildet i ~ 30 dager i de granulære hydrogelmatrisene og observert lignende arealutvidelse for både ikke-bevegelige og bevegelige celler for de første 150 timene; På enda lengre tidspunkter observeres imidlertid sterk variabilitet mellom prøvene, med noen prøver som viser raskere spredningshastigheter (figur 9 og figur 10). Interessant, ved omsampling av hydrogelmatrisen etter forsøket – en fordel med det store volumet av hydrogelmatrisen – måles en reduksjon i flytespenning, lagringsmoduli og tapsmoduli (figur 11), noe som indikerer at matrisene ble mykere. Denne endringen kan skyldes at V. cholerae produserer et molekyl som endrer hydrogelmatriseegenskapene og fremmer cellulær spredning i lange tider, noe som vil være interessant å teste i fremtidig forskning. Eksempler på de grove, fraktallignende kolonimorfologiene som resulterer i disse eksperimentene er vist i figur 10. Figur 1: Bilder av den spesialbygde 3D-bioprinteren. (A) Bioprinter med modifisert sprøytepumpe, ekstruderhode med Luer, lås, sprøyte og kanyle. Bioprinter er ~46 cm bred. (B) Bilde av 3D-utskrift av celler i kolber fylt med fastkjørt hydrogelmatrise. Bredden på bildet er 87 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Karakterisering av de reologiske egenskapene til de granulære hydrogelmatrisene. (A) Skjærspenning som en funksjon av den påførte skjærhastigheten. (B) Lagrings- og tapsmoduli, henholdsvis G ‘ og G’, som en funksjon av svingningsfrekvens. Legenden indikerer hydrogelmassefraksjonen som brukes til å fremstille hver hydrogelmatrise. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Porestørrelsesmålinger av to representative granulære hydrogelmatriser. Ved å spore sporstoffer bestemmes fordelingen av karakteristiske poredimensjoner for hver hydrogelmatrise. Dataene er representert av 1-CDF, der CDF er den kumulative fordelingsfunksjonen. Legenden indikerer hydrogelmassefraksjonen som brukes til å forberede hver matrise. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Eksempler på bobler dannet under 3D-printing av bakterier. (A) Skjematisk av bildeoppsettet. (B) Øyeblikksbilder av veksten av V. cholerae med en boble i bunnen av utskriften (rød boks) i 1,2% hydrogelmatrise hoven i LB. Etter 59 timers dyrking ved 37 °C er luftboblen fullstendig oppløst, og kolonien kollapser tilbake på grunn av hydrogelmatriksens elastisitet. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Bilder av den horisontale linjen av motile V. cholerae trykt i en seks-brønns plate fylt med 1,2% hydrogelmatrise hovent i LB og biofilmen som ble dannet på toppoverflaten etter 48 timers inkubasjon ved 37 ° C. (A) Skjematisk fremstilling av bildeoppsettet. (B) Biofilmdannelsen på den øverste overflaten på grunn av forurensning under 3D-utskrift reduserer opasiteten og tillater ikke klar avbildning av den horisontale linjen. Den øverste overflaten danner rynker, antagelig på grunn av differensiell vekst. Skala bar = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Eksempler på forskjellige prøvebeholdere som kan brukes i denne metoden. (A) V. cholerae trykt i et hetteglass fylt med 1,2% granulær hydrogelmatriks etter 470 timer. Krumningen av hetteglasset gjør det vanskelig å avbilde veksten. Skalastenger = 5 mm. (B) V. cholerae trykt i en mikrokuvette fylt med 1,2% granulær hydrogelmatriks. De flate sidene tillater klar avbildning, men de små volumene begrenser lengden på eksperimenter før cellene går tom for vekstsubstrater. (C) Bildeoppsett med zoomobjektiv til bilde V. cholerae trykt i en vevskulturkolbe fylt med 1,2% granulær hydrogelmatrise. I likhet med mikrokyvettekassen gir de flate sidene klar avbildning. Vevskulturkolbene kan fylles med større mengder granulær hydrogelmatrise, og dermed forlenge den eksperimentelle tidsperioden. (D) Bilde fra zoomlinsen til V. cholerae trykt inne i en 1,2 % granulær hydrogelmatrise etter 100 timers inkubasjon ved 37 °C. Skalastang = 1 mm. (E) Bildeoppsett med konfokalmikroskop for å avbilde fluorescerende celler. (F) 3D-projeksjon av konfokale mikrografer av fluorescerende E. coli inne i den 1,2% granulære hydrogelmatrisen etter 10 dagers inkubasjon ved 37 °C. Skala bar = 50 μm. (G) Enkeltcelleoppløsning konfokal mikrografi av fluorescerende E. coli inne i hydrogelmatrisen. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 7: Arealutvidelse som funksjon av tid for kolonier av V. cholerae trykt i 1 ml granulære hydrogelstøttematriser. Dataene på plottet er fra bildeanalysen av figur 8. Det ble observert at motile celler (lukket rød sirkel og firkant) spredte seg raskere enn de ikke-bevegelige cellene, noe som reflekterer spredning av både vekst og motilitet. I tillegg sprer de motile cellene i hydrogelmatrisen med en stor porestørrelse (røde firkanter) seg raskere enn cellene i hydrogelmatrisen med 0, 3 μm porer (røde sirkler). Ikke-bevegelige celler viser ingen forskjell i arealekspansjonshastighet mellom de to porestørrelsene, da de bare vokser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 8: Kolonier av V. cholerae trykt i 1 ml granulære hydrogelstøttematriser. (A) Øyeblikksbilder av vekst og motilitet av motile V. cholerae i 0,9% granulær hydrogelmatrise hvor porestørrelsen er større enn gjennomsnittlig cellediameter. Piler indikerer en diffus plume som dannes på grunn av celler som beveger seg gjennom hydrogelmatrisen. (B) Øyeblikksbilder av vekst og motilitet av motile V. cholerae i en 1,2% granulær hydrogelmatrise hvor porestørrelsen er mindre enn gjennomsnittlig cellediameter. Piler indikerer grov, fraktallignende søyle som dannes på grunn av cellulær vekst. (C) Øyeblikksbilder av tidsutviklingen av ikke-bevegelige V. cholerae i 0,9% granulær hydrogelmatrise hvor porestørrelsen er større enn gjennomsnittlig cellediameter. I dette tilfellet er diffuse plumes som reflekterer motilitet ikke observerbare. (D) Øyeblikksbilder av veksten av ikke-bevegelige V. cholerae i en 1,2% granulær hydrogelstøttematrise hvor porestørrelsen er mindre enn gjennomsnittlig cellediameter. I dette tilfellet er grove, fraktallignende søyler som reflekterer vekst igjen observerbare. Skalastenger = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 9: Arealutvidelse som funksjon av tid for kolonier av V. cholerae trykt i 20 ml 1,2% granulære hydrogelstøttematriser. Ikke-bevegelige (åpne sirkler) og bevegelige celler (lukkede sirkler) observeres å spre seg med tilsvarende hastigheter de første 100 timene. Etter 100 timer observeres forskjeller i arealekspansjonshastighetene, potensielt på grunn av utviklingen av variabilitet ved lange tider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 10: Kolonier av V. cholerae trykt i 22 ml 1,2% granulære hydrogelmatriser dyrket ved 37 ° C. (Øverst) Øyeblikksbilder av vekst av motile V. cholerae. (Nederst) Øyeblikksbilder av veksten av ikke-bevegelige V. cholerae. I begge tilfeller er grove, fraktallignende søyler som reflekterer vekst observerbare. Skalastenger = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 11: Karakterisering av de reologiske egenskapene til den 1,2% granulære hydrogelmatrisen før (0 timer) og etter forsøket (397 timer). (A) Skjærspenning som funksjon av den påførte skjærhastigheten. (B) Lagrings- og tapsmoduli, henholdsvis G’ og G”, som en funksjon av anvendt oscillasjonsfrekvens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Gcode-kommandoer Oppgaver M82 Absolutt ekstruderingsmodus M302 S0 Muliggjør kald ekstrudering M92 E14575 Angi ekstruderingstrinnene per mm G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 Sett z-aksen og ekstruderingsposisjonen til null, og x-,y-posisjonen til 35,71 mm og y 88 mm der skrivehodet er når g-koden starter M221 S100 T0 setter strømningshastigheten til 100 % M107 Slå av viften G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 Ekstruder 20 μL bioblekk inn i matrisen ved matehastighet på 50 μL/min der gjeldende posisjon ble satt G0 F200 Z60 Trekk kanylen ut av matriksen og prøvekontianeren med en hastighet på 200 mm/min G0 F500 X65.81 Y81.0 Flytt kanylen til neste prøvebeholder med en hastighet på 500 mm/min G0 F100 Z0 Senk kanylen ned i neste prøvebeholder til samme z-posisjon hvor utskriften startet med en hastighet på 100 mm/min G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 Ekstruder 20 μL bioblekk inn i matrisen ved matehastighet på 50 μL/min der gjeldende posisjon ble satt G0 F200 Z60 Trekk kanylen ut av matriksen og prøvekontianeren med en hastighet på 200 mm/min G0 F500 X96.01 Y81.0 Flytt kanylen til neste prøvebeholder med en hastighet på 500 mm/min G0 F100 Z0 Senk kanylen ned i prøvekontiaineren til samme z-posisjon hvor utskriften startet med en hastighet på 100 mm/min G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 Ekstruder 20 μL bioblekk inn i matrisen ved matehastighet på 50 μL/min der gjeldende posisjon ble satt G0 F200 Z60 Trekk kanylen ut av matriksen og prøvekontianeren med en hastighet på 200 mm/min G0 F500 X126.21 Y81.0 Flytt kanylen til neste prøvebeholder med en hastighet på 500 mm/min G0 F100 Z0 Senk kanylen ned i neste prøvebeholder til samme z-posisjon hvor utskriften startet med en hastighet på 100 mm/min G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 Ekstruder 20 μL bioblekk inn i matrisen ved matehastighet på 50 μL/min der gjeldende posisjon ble satt G0 F200 Z80 Trekk kanylen ut av matriksen og prøvekontianeren med en hastighet på 200 mm/min Tabell 1: G-kodeprogrammering for utskrift av vertikale linjer i bakteriesuspensjonen. Tilleggsfil 1: STL-fil for bunnklemmen 1 ml Luer-låssprøyter til engangs til sprøyteekstruderen. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 2: STL-fil for toppklemmen for 1 ml Luer-låssprøyter til engangs til sprøyteekstruderen. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 3: STL-fil for sprøyteadapteren for 1 ml Luer-låssprøyter til engangs til sprøyteekstruderen. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 4: STL-fil for kyvetteprøveholderen. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 5: STL-fil for vevskolbeprøveholderen. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 6: STL-fil for 6-brønnsplaten og 35 mm petriskakutskriftsseng. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 7: Egendefinert skript for partikkelsporing. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å sikre at matrisen er laget i et sterilt miljø når du forbereder hver hydrogelmatrise. Hvis ikke, kan forurensning oppstå, noe som manifesterer seg som for eksempel mikrokolonier (små sfæroider) i matrisen etter flere dager. Under blandingsprosessen er det viktig at alle tørre granulære hydrogelpartikler oppløses. I tillegg, når du justerer pH i hver hydrogelmatrise med NaOH, vil granulatene begynne å svulme, noe som øker viskositeten til hydrogelmatrisen, noe som fører til at blanding blir vanskeligere. Bruk av stativblanderen vil bidra til å sikre at NaOH blandes godt inn i hydrogelmatrisen. Under lasting av hver bakteriell suspensjon kan det dannes luftlommer i nålen. For å unngå dette problemet, sørg for at nålespissen alltid sitter i bakteriesuspensjonen i sentrifugerøret og ikke i bunnen av røret eller nær toppoverflaten. En annen måte å overvinne dette problemet på er å vokse store mengder celler og dermed ha større volumer av bakteriesuspensjonen for utskrift.

Begrensninger
For tiden, under utskrift, begrenser den lave viskositeten til bakteriell suspensjon geometriene som kan skrives ut og fører ofte til at en biofilm dannes og vokser på toppen av hydrogelmatriseoverflaten på grunn av sporceller. Det er noen potensielle metoder for å overvinne denne begrensningen, inkludert å øke viskositeten til bakteriesuspensjonen eller optimalisere 3D-skriverinnstillingene ytterligere. For å øke viskositeten til bakteriesuspensjonen kan man blande bakteriesuspensjonen med en annen polymer – for eksempel alginat, som tidligere har blitt brukt til 3D-printing av bakterier på flate overflater38. Skriverinnstillingene kan optimaliseres ytterligere for å muliggjøre tilbaketrekking av sprøytestempelet under uttak av nålen fra den granulære hydrogelmatriksen, noe som vil ha potensial til å stoppe celler fra å bli avsatt under fjerning av nålen fra hydrogelmatriksen.

Metodens betydning for eksisterende/alternative metoder
Metoden beskrevet her tillater utskrift av bakteriekolonier i granulære hydrogelmatriser. De granulære hydrogelmatrisene tillater studier av virkningen av eksterne miljøfaktorer (f.eks. Porestørrelse, matrisedeformbarhet) på motiliteten og veksten av bakterier. I tillegg, mens LB i dette arbeidet brukes som flytende vekstmedium for å svulme hydrogelmatrisen, kan hydrogelmatrisen bli hovent med andre flytende vekstmedier, inkludert medier med antibiotika. Tidligere metoder for å studere bakterier i begrensede miljøer var begrenset av lengden på eksperimentell tid, polymermaskestørrelsen og omkringliggende hydrogelmatriksstivhet37,38. Protokoller eksisterer allerede for å lage granulære hydrogelmatriser ut av forskjellige polymerer, så potensialet for å studere virkningen av forskjellige miljøforhold på motilitet og vekst av bakterier er stort. Denne metoden tillater studier av bakterier i kontrollmiljøer som lettere rekapitulerer miljøene som bakterier bor i den virkelige verden, for eksempel vertsslim eller jord. En annen begrensning av mange andre metoder er opasiteten til den omkringliggende matrisen; Imidlertid gir denne tilnærmingen ved hjelp av optisk gjennomsiktige materialer muligheten til å utforske, for eksempel optogenetisk kontroll og mønstre av bakterier i 3D.

Utover å studere motilitet og vekst, overvinner 3D-utskriftsmetoden beskrevet her begrensningen av mange andre bioprintingsmetoder som krever avsetning av et bioblekk på et substrat og er derfor begrenset i høyden av det konstruerte levende materialet de kan produsere. I fremtiden kan denne bioprintingsprotokollen utvides ytterligere for å fremstille biohybridmaterialer ved å blande polymerer med biofilmdannende celler. De granulære hydrogelmatrisene gir støtte for 3D-utskrift tykkere, større konstruerte levende materialer og mer komplekse geometrier enn mange andre nåværende bakteriebioprintingsmetoder. Mens dette arbeidet bare brukte V. cholerae og E. coli, har andre arter, som Pseudomonas aeruginosa, også blitt 3D-printet37. Utover utskrift kan skriveren tilpasses til å gjøre en kontrollert prøvetaking av bakterier etter vekst for å se om det har skjedd noen genetiske endringer, for eksempel.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RKB anerkjenner støtte fra Presidential Postdoctoral Research Fellows Program. Dette materialet er også basert på arbeid støttet av NSF Graduate Research Fellowship Program Grant DGE-2039656 (til AMH). ASD-M. og HNL anerkjenner støtte fra Lidow Independent Work / Senior Thesis Fund ved Princeton University. Vi takker også laboratoriet til Bonnie Bassler for å gi stammer av V. cholerae. SSD anerkjenner støtte fra NSF Grants CBET-1941716, DMR-2011750 og EF-2124863, samt Eric og Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, New Jersey Health Foundation, Pew Biomedical Scholars Program og Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.

Materials

1 mL cuvettes VWR 97000-586
1 mL Luer lock syringe BH Supplies BH1LL
10 M NaOH Sigma-Aldrich 72068
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres)   Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)
F8803
15 mL centrifuge tubes ThermoFischer Scientific 14-955-237
20 G blunt needle McMaster Carr 75165A252
25 mL tissue culture flasks VWR 10861-566
3D printer Lulzbot LulzBot Mini 2
3D printing software Cura Cura-Lulzbot
50 mL centrifuge tubes ThermoFischer Scientific 14-955-239
Agar Sigma-Aldrich A1296
Carbomer Granular Hydrogel Particles Lubrizol  Carbopol 980NF dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers
Centrifuge (2 mL tube capacity) VWR 2405-37
Centrifuge (50 mL tube capacity) ThermoFischer Scientific 75007200 Sorvall (brand) ST 8 (model)
Confocal Microscope Nikon A1R+ inverted laserscanning
confocal microscope
Glass bottom petri dish Cellvis D35-10-1-N
Lennox LB (Lubria Broth) Sigma-Aldrich L3022
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap McMaster Carr 91290A478
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut McMaster Carr 93187A300
Open-source syringe pump Custom-made Replistruder 4 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791
Petri dish (60 mm round) ThermoFischer Scientific FB0875713A
Shear Rheometer Anton Paar MCR 501
Ultrasonic cleaner VWR 97043-992

References

  1. Persat, A., et al. The mechanical world of bacteria. Cell. 161 (5), 988-997 (2015).
  2. Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
  3. Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
  4. Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387 (2017).
  5. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).
  6. Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
  7. Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
  8. Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
  9. Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
  10. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  11. Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
  12. Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
  13. O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
  14. Gill, C. O., Penney, N. Penetration of bacteria into meat. Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).
  15. Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
  16. Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
  17. Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
  18. Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
  19. de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
  20. Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
  21. Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
  22. Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
  23. Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
  24. Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
  25. Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
  26. Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063 (2022).
  27. Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380 (2022).
  28. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
  29. Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
  30. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
  31. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
  32. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
  33. Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. Chemotactic smoothing of collective migration. eLife. 11, e71226 (2022).
  34. Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170 (2021).
  35. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  36. Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671 (2017).
  37. Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119 (2022).
  38. Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
  39. Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118 (2021).

Play Video

Cite This Article
Bay, R. K., Hancock, A. M., Dill-Macky, A. S., Luu, H. N., Datta, S. S. 3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media. J. Vis. Exp. (203), e66166, doi:10.3791/66166 (2024).

View Video