Summary

Immunmagnetisk isolasjon av de vaskulære veggresidente CD34+ -stamcellene fra mus

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

Denne studien har etablert en stabil og effektiv metode for isolering, kultur og funksjonell bestemmelse av vaskulære vegg-residente CD34+ -stamceller (CD34+ VW-SC). Denne enkle å følge og tidseffektive isolasjonsmetoden kan brukes av andre etterforskere for å studere de potensielle mekanismene involvert i hjerte- og karsykdommer.

Abstract

Residente CD34+ vaskulære vegg-residente stam- og stamceller (VW-SC) blir i økende grad anerkjent for sin avgjørende rolle i å regulere vaskulær skade og reparasjon. Å etablere en stabil og effektiv metode for å dyrke funksjonelle murine CD34+ VW-SC-er er avgjørende for å undersøke mekanismene som er involvert i spredning, migrasjon og differensiering av disse cellene under ulike fysiologiske og patologiske forhold. Den beskrevne metoden kombinerer magnetisk perlescreening og flowcytometri for å rense primære dyrkede CD34+ VW-SC-er. De rensede cellene blir deretter funksjonelt identifisert gjennom immunfluorescensfarging og Ca2+ -avbildning. Kort fortalt oppnås vaskulære celler fra adventitia av murine aorta og mesenteric arterie gjennom vevsblokkfeste, etterfulgt av subkulturasjon til det når et celletall på minst 1 × 107. Deretter renses CD34+ VW-SC-er ved hjelp av magnetisk perlesortering og flowcytometri. Identifikasjon av CD34+ VW-SC-er involverer cellulær immunfluorescensfarging, mens funksjonell multipotens bestemmes ved å utsette celler for et spesifikt kulturmedium for orientert differensiering. Videre vurderes funksjonell intern Ca2+- frigjøring og ekstern Ca2+- inngang ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig bildearbeidsstasjon i Fura-2/AM-belastede celler utsatt for ATP, koffein eller thapsigargin (TG). Denne metoden tilbyr en stabil og effektiv teknikk for å isolere, dyrke og identifisere vaskulære vegg-residente CD34+- stamceller, og gir en mulighet for in vitro-studier av reguleringsmekanismene til VW-SC-er og screening av målrettede legemidler.

Introduction

Karveggen spiller en sentral rolle i vaskulær utvikling, homeostatisk regulering og progresjon av vaskulære sykdommer. De siste årene har en rekke studier avduket tilstedeværelsen av ulike stamcellelinjer i arterier. I 2004 rapporterte professor Qingbo Xus gruppe først eksistensen av vaskulære stam-/stamceller i periferien av den voksne vaskulære veggen, som uttrykker CD34, Sca-1, c-kit og Flk-11. Disse vaskulære stamcellene viser multidireksjonell differensiering og spredningspotensial. Under normale forhold forblir de relativt rolige; men når de aktiveres av spesifikke faktorer, kan de differensiere til glatte muskelceller, endotelceller og fibroblaster. Alternativt kan de regulere den perivaskulære matrisen og mikrokardannelsen gjennom parakrine effekter for å fremme reparasjon eller ombygging av skadede kar 2,3,4,5,6. Nylig ble det funnet at residente CD34+-stamceller i karveggen spilte en rolle i endotelcelleregenerering etter lårarterie guidewire-skade2. Følgelig er isolering og kvantifisering av CD34+ VW-SC og undersøkelsen av de grunnleggende biologiske egenskapene til CD34+ stamceller avgjørende for videre å studere signalveiene som er involvert i reguleringen av CD34+ VW-SC.

Ulike metoder for celleseparasjon er for tiden tilgjengelige, inkludert teknikker basert på cellekulturegenskaper eller fysiske egenskaper til celler som tetthetsgradientsentrifugering, noe som resulterer i sorterte celler som inneholder mange ikke-målceller og relativt lav renhet 7,8,9,10,11,12 . En annen ofte brukt teknikk er fluorescens/magnetassistert cellesortering. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) er et komplekst system med høye tekniske krav, og det er relativt dyrt, tidkrevende og potensielt påvirker aktiviteten til sorterte celler13,14. Magnetisk aktivert cellesortering (MACS) er imidlertid mer effektiv og praktisk, med høy gjenopprettingshastighet og celleaktivitet og mindre innvirkning på nedstrømsapplikasjoner8. Derfor, i denne protokollen, brukte vi MACS for å rense CD34+ VW-SC-er og identifiserte cellene ytterligere ved flowcytometri. Etableringen av MACS-baserte isolasjonsmetoder for å studere vaskulære veggstamceller ville være uvurderlig. For det første tillater det eksperimentelle genetiske og cellebiologiske studier. For det andre tillater effektiv isolering og dyrking av stamceller fra karveggen systematisk vurdering og screening av signalfaktorer som regulerer stamcellefunksjoner. For det tredje gir identifisering av viktige fenotyper i stamceller viktig “kvalitetskontroll” i vurderingen av cellestatus. Dermed kan identifisering av metoder for rensing være nyttig for lignende applikasjoner som analoge stamceller avledet fra kar.

Denne rapporten gir en detaljert demonstrasjon av en stabil og pålitelig metode for dyrking av CD34+ VW-SC-er, inkludert celleidentifikasjon og funksjonsvurdering utført ved flowcytometri, immunfluorescensfarging og Ca2+ signalmåling. Denne studien gir grunnlag for videre dybdeforskning på funksjonen til CD34+ VW-SC og deres reguleringsmekanismer ved fysiologiske og patologiske tilstander.

Protocol

Denne studien ble godkjent, og dyrene ble håndtert i henhold til retningslinjene for håndtering og bruk av forsøksdyr i Kina. Forskningen overholdt strengt de etiske kravene til dyreforsøk, med godkjenning fra Dyreetisk komité (godkjenningsnummer: SWMU2020664). Åtte uker gamle friske C57BL/6-mus av begge kjønn, som veide mellom 18-20 g, ble brukt til denne studien. Dyrene ble plassert på Laboratory Animal Center ved Southwest Medical University (SWMU). 1. Vevsblokkkultur av adven…

Representative Results

Isolering og rensing av CD34+ VW-SCHøy renhet av CD34+ VW-SC oppnås fra adventitia av musens aorta og mesenteriske arterie ved vevsfeste og magnetisk mikroperlesortering. Prosentandelen CD34+- celler i karveggen er generelt 10%-30%. Flowcytometri bekrefter at renheten til CD34+ -celler oppnådd ved magnetisk perlesortering er mer enn 90 % (figur 1A). Cellulær immunfluorescensfarging viser at CD34+ VW-SC-er hovedsa…

Discussion

Denne studien gir en rask og praktisk metode for å skaffe funksjonelle CD34+ VW-SC-er fra aorta og mesenteriske arterier hos mus. CD34+ VW-SC-er oppnådd ved denne metoden har proliferativ aktivitet og multidireksjonell differensieringsegenskaper. Trifosfatinositol 1,4,5-trisfosfatreseptorer (IP3R), ryanodinreseptorer (RyR) og butikkopererte kalsiumkanaler medierer Ca2+ frigjøring og inntreden i CD34+ VW-SC. Etableringen av denne teknikken vil legge grunnlaget for …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (No. 82070502, 31972909, 32171099), Sichuan Science and Technology Program of Sichuan-provinsen (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Forfatterne vil gjerne takke Qingbo Xu fra Zhejiang University for hjelp med cellekulturen, og forfatterne anerkjenner den vitenskapelige og tekniske assistansen fra flowcytometriplattformen ved Southwest Medical University.

Materials

2% gelatin solution Sigma G1393
Anti-CD31 antibody R&D AF3628
Anti-CD34 antibody Abcam ab81289
Anti-c-kit antibody CST 77522
Anti-FITC MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody Abcam ab24313
Anti-Ki67 antibody CST 34330
Anti-PDGFRα antibody Abcam ab131591
Anti-Sca- 1 antibody Invitrogen 710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC eBioscience  Invitrogen 11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC eBioscience  Invitrogen 17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383 Miltenyi Biotec 130-117-775
cell culture hood JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD  SW-CJ-2FD
Centrifuge   CENCE   L530
CO2 incubators             Thermofisher Scientific 4111
Confocal laser scanning microscope  Zeiss  zeiss 980  
DMEM High Glucose Medium ATCC 30-2002
EBM-2 culture medium Lonza CC-3162
FACSMelody   BD Biosciences
FACSMelody™ System  BD
Fetal bovine serum Millipore ES-009-C
FM-2 culture medium ScienCell 2331
Fura-2/AM  Invitrogen M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488  Thermofisher Scientific    A32731
Leukemia inhibitory factor Millipore LIF2010
Microscope  Olympus IX71
MiniMACS   Starting Kit Miltenyi Biotec 130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution Beyotime C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Pharmingen 553141
Stereo Microscope  Olympus SZX10 
TILLvisION 4.0 program   T.I.L.L.Photonics GmbH polychrome V 
VWF Monoclonal Antibody (F8/86) Thermofisher Scientific  MA5-14029
β-Mercaptoethanol Thermofisher Scientific 21985023

References

  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al. Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery. Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).
  3. Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells. Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).
  4. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
  5. Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. Roles of stem cells in vascular remodeling. Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).
  6. Zhang, L., et al. Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis. Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).
  7. Wu, Y., et al. Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).
  8. Tang, J. M., et al. Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).
  9. Sukumaran, P., et al. Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis. Cells. 10 (8), 2125 (2021).
  10. van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. Optimizing stem cell culture. J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).
  11. Rotmans, J. I., et al. In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts. Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).
  12. Qu, R., et al. The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187 (2022).
  13. Flynn, J., Gorry, P. Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells. Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).
  14. Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies. Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).
  15. Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells. Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).
  16. Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells. Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).
  17. Kumar, P., Garg, N. Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures. Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).
  18. Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes. Bio Protoc. 12 (2), e4299 (2022).
  19. Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration. PLOS One. 15 (2), e0229504 (2020).
  20. Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits. Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).
  21. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PLOS One. 14 (3), e0213832 (2019).
  22. Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration. Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).
  23. Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).
  24. Garcia-Carlos, C. A., et al. Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures. Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).
  25. Reggiani, C. Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles. J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).

Play Video

Cite This Article
Han, C., Xie, C., Dang, Q., Zhang, X., Li, C., Yang, Y., Cheng, J., Li, P. Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice. J. Vis. Exp. (202), e66193, doi:10.3791/66193 (2023).

View Video