Denne studien har etablert en stabil og effektiv metode for isolering, kultur og funksjonell bestemmelse av vaskulære vegg-residente CD34+ -stamceller (CD34+ VW-SC). Denne enkle å følge og tidseffektive isolasjonsmetoden kan brukes av andre etterforskere for å studere de potensielle mekanismene involvert i hjerte- og karsykdommer.
Residente CD34+ vaskulære vegg-residente stam- og stamceller (VW-SC) blir i økende grad anerkjent for sin avgjørende rolle i å regulere vaskulær skade og reparasjon. Å etablere en stabil og effektiv metode for å dyrke funksjonelle murine CD34+ VW-SC-er er avgjørende for å undersøke mekanismene som er involvert i spredning, migrasjon og differensiering av disse cellene under ulike fysiologiske og patologiske forhold. Den beskrevne metoden kombinerer magnetisk perlescreening og flowcytometri for å rense primære dyrkede CD34+ VW-SC-er. De rensede cellene blir deretter funksjonelt identifisert gjennom immunfluorescensfarging og Ca2+ -avbildning. Kort fortalt oppnås vaskulære celler fra adventitia av murine aorta og mesenteric arterie gjennom vevsblokkfeste, etterfulgt av subkulturasjon til det når et celletall på minst 1 × 107. Deretter renses CD34+ VW-SC-er ved hjelp av magnetisk perlesortering og flowcytometri. Identifikasjon av CD34+ VW-SC-er involverer cellulær immunfluorescensfarging, mens funksjonell multipotens bestemmes ved å utsette celler for et spesifikt kulturmedium for orientert differensiering. Videre vurderes funksjonell intern Ca2+- frigjøring og ekstern Ca2+- inngang ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig bildearbeidsstasjon i Fura-2/AM-belastede celler utsatt for ATP, koffein eller thapsigargin (TG). Denne metoden tilbyr en stabil og effektiv teknikk for å isolere, dyrke og identifisere vaskulære vegg-residente CD34+- stamceller, og gir en mulighet for in vitro-studier av reguleringsmekanismene til VW-SC-er og screening av målrettede legemidler.
Karveggen spiller en sentral rolle i vaskulær utvikling, homeostatisk regulering og progresjon av vaskulære sykdommer. De siste årene har en rekke studier avduket tilstedeværelsen av ulike stamcellelinjer i arterier. I 2004 rapporterte professor Qingbo Xus gruppe først eksistensen av vaskulære stam-/stamceller i periferien av den voksne vaskulære veggen, som uttrykker CD34, Sca-1, c-kit og Flk-11. Disse vaskulære stamcellene viser multidireksjonell differensiering og spredningspotensial. Under normale forhold forblir de relativt rolige; men når de aktiveres av spesifikke faktorer, kan de differensiere til glatte muskelceller, endotelceller og fibroblaster. Alternativt kan de regulere den perivaskulære matrisen og mikrokardannelsen gjennom parakrine effekter for å fremme reparasjon eller ombygging av skadede kar 2,3,4,5,6. Nylig ble det funnet at residente CD34+-stamceller i karveggen spilte en rolle i endotelcelleregenerering etter lårarterie guidewire-skade2. Følgelig er isolering og kvantifisering av CD34+ VW-SC og undersøkelsen av de grunnleggende biologiske egenskapene til CD34+ stamceller avgjørende for videre å studere signalveiene som er involvert i reguleringen av CD34+ VW-SC.
Ulike metoder for celleseparasjon er for tiden tilgjengelige, inkludert teknikker basert på cellekulturegenskaper eller fysiske egenskaper til celler som tetthetsgradientsentrifugering, noe som resulterer i sorterte celler som inneholder mange ikke-målceller og relativt lav renhet 7,8,9,10,11,12 . En annen ofte brukt teknikk er fluorescens/magnetassistert cellesortering. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) er et komplekst system med høye tekniske krav, og det er relativt dyrt, tidkrevende og potensielt påvirker aktiviteten til sorterte celler13,14. Magnetisk aktivert cellesortering (MACS) er imidlertid mer effektiv og praktisk, med høy gjenopprettingshastighet og celleaktivitet og mindre innvirkning på nedstrømsapplikasjoner8. Derfor, i denne protokollen, brukte vi MACS for å rense CD34+ VW-SC-er og identifiserte cellene ytterligere ved flowcytometri. Etableringen av MACS-baserte isolasjonsmetoder for å studere vaskulære veggstamceller ville være uvurderlig. For det første tillater det eksperimentelle genetiske og cellebiologiske studier. For det andre tillater effektiv isolering og dyrking av stamceller fra karveggen systematisk vurdering og screening av signalfaktorer som regulerer stamcellefunksjoner. For det tredje gir identifisering av viktige fenotyper i stamceller viktig “kvalitetskontroll” i vurderingen av cellestatus. Dermed kan identifisering av metoder for rensing være nyttig for lignende applikasjoner som analoge stamceller avledet fra kar.
Denne rapporten gir en detaljert demonstrasjon av en stabil og pålitelig metode for dyrking av CD34+ VW-SC-er, inkludert celleidentifikasjon og funksjonsvurdering utført ved flowcytometri, immunfluorescensfarging og Ca2+ signalmåling. Denne studien gir grunnlag for videre dybdeforskning på funksjonen til CD34+ VW-SC og deres reguleringsmekanismer ved fysiologiske og patologiske tilstander.
Denne studien gir en rask og praktisk metode for å skaffe funksjonelle CD34+ VW-SC-er fra aorta og mesenteriske arterier hos mus. CD34+ VW-SC-er oppnådd ved denne metoden har proliferativ aktivitet og multidireksjonell differensieringsegenskaper. Trifosfatinositol 1,4,5-trisfosfatreseptorer (IP3R), ryanodinreseptorer (RyR) og butikkopererte kalsiumkanaler medierer Ca2+ frigjøring og inntreden i CD34+ VW-SC. Etableringen av denne teknikken vil legge grunnlaget for …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (No. 82070502, 31972909, 32171099), Sichuan Science and Technology Program of Sichuan-provinsen (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Forfatterne vil gjerne takke Qingbo Xu fra Zhejiang University for hjelp med cellekulturen, og forfatterne anerkjenner den vitenskapelige og tekniske assistansen fra flowcytometriplattformen ved Southwest Medical University.
2% gelatin solution | Sigma | G1393 | |
Anti-CD31 antibody | R&D | AF3628 | |
Anti-CD34 antibody | Abcam | ab81289 | |
Anti-c-kit antibody | CST | 77522 | |
Anti-FITC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
Anti-FITC MicroBeads MACS | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
Anti-Flk- 1 antibody | Abcam | ab24313 | |
Anti-Ki67 antibody | CST | 34330 | |
Anti-PDGFRα antibody | Abcam | ab131591 | |
Anti-Sca- 1 antibody | Invitrogen | 710952 | |
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC | eBioscience Invitrogen | 11-1401-82 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC | eBioscience Invitrogen | 17-0311-82 | |
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383 | Miltenyi Biotec | 130-117-775 | |
cell culture hood | JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD | SW-CJ-2FD | |
Centrifuge | CENCE | L530 | |
CO2 incubators | Thermofisher Scientific | 4111 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | zeiss 980 | |
DMEM High Glucose Medium | ATCC | 30-2002 | |
EBM-2 culture medium | Lonza | CC-3162 | |
FACSMelody | BD Biosciences | ||
FACSMelody™ System | BD | ||
Fetal bovine serum | Millipore | ES-009-C | |
FM-2 culture medium | ScienCell | 2331 | |
Fura-2/AM | Invitrogen | M1292 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermofisher Scientific | A32731 | |
Leukemia inhibitory factor | Millipore | LIF2010 | |
Microscope | Olympus | IX71 | |
MiniMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-312 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Beyotime | C0224 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | |
TILLvisION 4.0 program | T.I.L.L.Photonics GmbH | polychrome V | |
VWF Monoclonal Antibody (F8/86) | Thermofisher Scientific | MA5-14029 | |
β-Mercaptoethanol | Thermofisher Scientific | 21985023 |