Undersøgelsen af peroxidase-positive leukocytter i sæd
Summary
Dette papir præsenterer en økonomisk og effektiv protokol til undersøgelse af peroxidase-positive leukocytter i sæd. Ved hjælp af et computerassisteret sædanalysesystem (CASA) kan koncentrationen af peroxidase-positive leukocytter i sæd opnås inden for i alt 60 minutter, hvilket effektivt forbedrer effektiviteten af andrologilaboratoriet og andrologerne.
Abstract
Leukocytospermi kan føre til nedsat spermatozomotilitet, øgede spermatozoer morfologiske abnormiteter, forhøjet spermatozo DNA-fragmenteringsindeks, forringelse af spermatozoernes akrosomfunktion og endda påvirket embryonal udvikling. Det er en almindelig andrologisk sygdom i klinisk praksis og en af de vigtige årsager til mandlig infertilitet. Ved bestemmelse af, om der findes betændelse i de reproduktive kanaler hos mænd, vælger androloger ofte at undersøge runde celler eller sædplasmaelastase i sæden som et klinisk diagnostisk grundlag. Undersøgelsen af runde celler påvirkes imidlertid let af sloughed spermatogene celler og reproduktive epitelceller, som ikke bidrager til at reducere den vilkårlige og unødvendige brug af antibiotika. Samtidig er detektionsprocessen for elastase relativt kompliceret, tidskrævende og langsom i rapporteringen af resultater, hvilket ikke er gavnligt for tidlig diagnose og behandling af sygdomme som mandlige kønsorgansinfektioner (MGTI’er). Vi har innovativt anvendt undersøgelsen af peroxidase-positive leukocytter i sæd assisteret af et computerassisteret sædanalysesystem (CASA) som et diagnostisk kriterium for leukocytospermi, med succes at løse disse problemer. Denne undersøgelse kræver kun tilsætning af driftsvæsken bestående af fire reagenser i prøven, og den samlede reaktionstid ved stuetemperatur kan styres inden for 20-30 minutter. Ved den efterfølgende udtværing og mikroskopiske undersøgelse kan koncentrationen af peroxidase-positive leukocytter i sæd opnås inden for i alt 60 minutter, som kan bruges til at diagnosticere, om betændelsen i den mandlige reproduktive kanal eksisterede.
Introduction
Infertilitet er opstået som et globalt folkesundhedsproblem, der påvirker ca. 15% af par i deres reproduktive alder. Mandlige faktorer bidrager med omkring 50% af de samlede subfertilitetstilfælde, og næsten 20% til 30% kan udelukkende tilskrives mandlige faktorer 1,2,3. Mandlige kønsorganer (MGTI’er) udgør en af de væsentlige årsager til mandlig infertilitet og tegner sig for ca. 15% af tilfældene 4,5.
De fleste individer har leukocytter i deres sæd, der udgør 13% af ikke-spermatozoiske celler, hvor differentielle proportioner er neutrofiler 12%, makrofager 0,9% og lymfocytter 0,1%6,7. Ifølge Verdenssundhedsorganisationens (WHO) laboratoriemanual til undersøgelse og behandling af human sæd (5. udgave) defineres leukocytospermi normalt som tilstedeværelsen af >1 × 106 celler / ml leukocytter i sæd8. Denne tilstand kan være forårsaget af mange faktorer såsom miljøgifte, stofmisbrug, varicoceles, MGTI’er osv., Som alle potentielt fører til en unormal stigning i leukocytkoncentrationen i sæd9. Leukocytter kan hæve niveauet af reaktive iltarter (ROS) i sæd, hvilket forårsager lipidperoxidering og oxidativ skade på protein og DNA, hvilket resulterer i nedsat spermatozomotilitet, øgede spermatozomorfologiske abnormiteter, forhøjet spermatozo-DNA-fragmenteringsindeks, forringelse af spermatozoernes akrosomfunktion og endda negative virkninger på embryoudvikling10,11.
I øjeblikket vælger androloger almindeligvis at undersøge runde celler i sæd eller elastase i sædplasma, når de identificerer betændelse i kønsorganerne. Det er dog ofte udfordrende at skelne mellem sloughed spermatogene celler og reproduktive epitelceller, som ikke bidrager til at reducere den vilkårlige og unødvendige brug af antibiotika6. Sidstnævnte undersøgelsesmetode er relativt kompliceret og tidskrævende med langsom resultatrapportering, hvilket ikke er gavnligt for tidlig diagnose og behandling af sygdomme som MGTI’er. American Urological Association (AUA) foreslår, at der foretages yderligere differentiering mellem leukocytter og sloughed celler fra kønsorganerne, når den runde cellekoncentration i sædanalyse er større end 1 × 106 celler / ml12. Nogle andrologilaboratorier bruger flowcytometri13 eller leukocytantigen (f.eks. CD45) immuncytokemi14 til at undersøge leukocytter. Selvom disse metoder er præcise, er de dyre og tidskrævende, hvilket gør storstilet klinisk implementering vanskelig, især i udviklingslande.
Peroxidase er bredt fordelt i forskellige typer celler og spiller en afgørende rolle i modstanden mod oxidativ stressskade. Myeloperoxidase (MPO) er medlem af peroxidase-underfamilien, der generelt udtrykkes i immunceller. Det udtrykkes højest i neutrofilers azurofile granulater15,16 og udtrykkes også i lymfocytter17,18, monocytter og makrofager19. Koncentrationen af leukocytter, især neutrofiler, i sæd kan opnås ved at undersøge runde celler, der er peroxidase-positive 7,20. For at gøre undersøgelsesprocessen for leukocytter i sæd økonomisk, praktisk og effektiv rekonstruerede vi undersøgelsesmetoden. Assisteret af det computerassisterede sædanalysesystem (CASA) kan koncentrationen af leukocytter opnås inden for 60 minutter. Denne nye metode reducerer patienternes undersøgelsesomkostninger og ventetid på at opnå resultater, letter arbejdsbyrden for laboratorieteknikere og forkorter lægens diagnose og behandlingsventetid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ortho-toluidin og hydrogenperoxid har lysfølsomme egenskaber og kan nedbrydes, når de udsættes for lys. For at sikre effektiviteten af testreagenserne anbefales det, at den fremstillede arbejdsvæske opbevares på et mørkt sted.
Sædprøver udviser naturligt heterogene egenskaber. I fremstillingsprocessen af sædprøver er korrekt bedømmelse af sædens flydende tilstand og grundig homogenisering af sædprøverne før hver prøveudtagning afgørende for at forbedre testresultaternes påli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for Andrology Laboratory ved Center for Reproduktiv Medicin, det tredje tilknyttede hospital ved Sun Yat-sen University, for at levere faciliteterne til denne undersøgelse. Der var ingen finansiering involveret i udarbejdelsen af denne artikel.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
