Het onderzoek van peroxidase-positieve leukocyten in sperma
Summary
Dit artikel presenteert een economisch en efficiënt protocol voor het onderzoeken van peroxidase-positieve leukocyten in sperma. Met behulp van een computerondersteund sperma-analysesysteem (CASA) kan de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten in sperma binnen een totaal van 60 minuten worden verkregen, waardoor de efficiëntie van andrologielaboratoria en andrologen effectief wordt verbeterd.
Abstract
Leukocytospermie kan leiden tot verminderde beweeglijkheid van de spermatozoa, verhoogde morfologische afwijkingen van de spermatozoa, verhoogde DNA-fragmentatie-index van de spermatozoa, verslechtering van de acrosoomfunctie van de spermatozoa en zelfs tot een verminderde embryonale ontwikkeling. Het is een veel voorkomende andrologische ziekte in de klinische praktijk en een van de belangrijke oorzaken van mannelijke onvruchtbaarheid. Bij het bepalen of er sprake is van ontsteking van het mannelijke voortplantingsstelsel, kiezen andrologen er vaak voor om ronde cellen of zaadplasma-elastase in het sperma te onderzoeken als klinische diagnostische basis. Het onderzoek van ronde cellen wordt echter gemakkelijk beïnvloed door afgestoten spermatogene cellen en epitheelcellen van het voortplantingsstelsel, die niet bijdragen aan het verminderen van het willekeurige en onnodige gebruik van antibiotica. Tegelijkertijd is het detectieproces van elastase relatief ingewikkeld, tijdrovend en traag in het rapporteren van resultaten, wat niet gunstig is voor vroege diagnose en behandeling van ziekten zoals infecties van de mannelijke geslachtsorganen (MGTI’s). We hebben het onderzoek van peroxidase-positieve leukocyten in sperma, ondersteund door een computerondersteund sperma-analysesysteem (CASA), op innovatieve wijze toegepast als diagnostisch criterium voor leukocytospermie, waardoor deze problemen met succes zijn opgelost. Dit onderzoek vereist alleen de toevoeging van de bedrijfsvloeistof bestaande uit vier reagentia aan het monster, en de totale reactietijd bij kamertemperatuur kan binnen 20-30 minuten worden geregeld. Met het daaropvolgende uitstrijkje en microscopisch onderzoek kan de concentratie van peroxidase-positieve leukocyten in sperma worden verkregen binnen een totaal van 60 minuten, die kan worden gebruikt om te diagnosticeren of de ontsteking van het mannelijke voortplantingsstelsel bestond.
Introduction
Onvruchtbaarheid is naar voren gekomen als een wereldwijd probleem voor de volksgezondheid dat ongeveer 15% van de paren in hun vruchtbare leeftijd treft. Mannelijke factoren worden bijgedragen door ongeveer 50% van de totale gevallen van subfertiliteit, en bijna 20% tot 30% kan uitsluitend worden toegeschreven aan mannelijke factoren 1,2,3. Infecties van de mannelijke geslachtsorganen (MGTI’s) vormen een van de belangrijkste oorzaken van mannelijke onvruchtbaarheid, goed voor ongeveer 15% van de gevallen 4,5.
De meeste mensen hebben leukocyten in hun sperma, die 13% van de niet-spermatozoaire cellen uitmaken, met differentiële verhoudingen als neutrofielen 12%, macrofagen 0,9% en lymfocyten 0,1%6,7. Volgens de laboratoriumhandleiding van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) voor het onderzoek en de verwerking van menselijk sperma (5e ed.) wordt leukocytospermie meestal gedefinieerd als de aanwezigheid van >1 × 106 cellen/ml leukocyten in sperma8. Deze aandoening kan worden veroorzaakt door tal van factoren, zoals milieutoxines, middelenmisbruik, varicoceles, MGTI’s, enz., die allemaal kunnen leiden tot een abnormale toename van de leukocytenconcentratie in sperma9. Leukocyten kunnen de niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in sperma verhogen, wat lipideperoxidatie en oxidatieve schade aan eiwitten en DNA veroorzaakt, wat resulteert in verminderde beweeglijkheid van de spermatozoa, verhoogde morfologische afwijkingen van de spermatozoa, verhoogde DNA-fragmentatie-index van de spermatozoa, verslechtering van de acrosoomfunctie van de spermatozoa en zelfs negatieve effecten op de ontwikkeling van het embryo10,11.
Momenteel kiezen andrologen er vaak voor om ronde cellen in sperma of elastase in zaadplasma te onderzoeken bij het identificeren van ontsteking van de geslachtsorganen. Het is echter vaak een uitdaging om onderscheid te maken tussen afgespoelde spermatogene cellen en epitheelcellen van het voortplantingsstelsel, die niet bijdragen aan het verminderen van het willekeurige en onnodige gebruik van antibiotica6. De laatste onderzoeksmethode is relatief ingewikkeld en tijdrovend, met trage rapportage van resultaten, wat niet gunstig is voor een vroege diagnose en behandeling van ziekten zoals MGTI’s. De American Urological Association (AUA) stelt voor om verder onderscheid te maken tussen leukocyten en afgespoelde cellen uit het geslachtsorgaan wanneer de ronde celconcentratie in sperma-analyse groter is dan 1 × 106 cellen/ml12. Sommige andrologielaboratoria gebruiken flowcytometrie13 of leukocytenantigeen (bijv. CD45) immunocytochemie14 om leukocyten te onderzoeken. Hoewel deze methoden nauwkeurig zijn, zijn ze duur en tijdrovend, waardoor grootschalige klinische implementatie moeilijk is, vooral in ontwikkelingslanden.
Peroxidase is wijd verspreid in verschillende soorten cellen en speelt een cruciale rol bij de weerstand tegen oxidatieve stressschade. Myeloperoxidase (MPO) is een lid van de peroxidase-subfamilie die over het algemeen tot expressie komt in immuuncellen. Het komt het sterkst tot expressie in de azurofiele korrelsvan neutrofielen 15,16 en komt ook tot expressie in lymfocyten17,18, monocyten en macrofagen19. De concentratie van leukocyten, vooral neutrofielen, in sperma kan worden verkregen door ronde cellen te onderzoeken die peroxidase-positiefzijn 7,20. Om het onderzoeksproces van leukocyten in sperma economisch, gemakkelijk en efficiënt te maken, hebben we de onderzoeksmethode opnieuw ontworpen. Met behulp van het computerondersteunde sperma-analysesysteem (CASA) kan de concentratie leukocyten binnen 60 minuten worden verkregen. Deze nieuwe methode verlaagt de onderzoekskosten van de patiënt en de wachttijd voor het verkrijgen van resultaten, verlicht de werklast van laboranten en verkort de wachttijd voor de diagnose en behandeling van de arts.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ortho-toluïdine en waterstofperoxide hebben lichtgevoelige eigenschappen en kunnen ontleden bij blootstelling aan licht. Om de doeltreffendheid van de testreagentia te garanderen, wordt aanbevolen de bereide werkvloeistof op een donkere plaats te bewaren.
Spermamonsters vertonen van nature heterogene kenmerken. Bij de bereiding van spermamonsters is het correct beoordelen van de vloeibaarmakingstoestand van sperma en het grondig homogeniseren van de spermamonsters vóór elke bemonstering va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn het Andrologielaboratorium van het Center for Reproductive Medicine, het derde aangesloten ziekenhuis van de Sun Yat-sen University, dankbaar voor het verstrekken van de faciliteiten voor deze studie. Bij de voorbereiding van dit artikel was geen financiering betrokken.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
