L’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme
Summary
Cet article présente un protocole économique et efficace pour l’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme. À l’aide d’un système d’analyse de sperme assisté par ordinateur (CASA), la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase dans le sperme peut être obtenue en 60 minutes au total, ce qui améliore efficacement l’efficacité du laboratoire d’andrologie et des andrologues.
Abstract
La leucocytospermie peut entraîner une diminution de la motilité des spermatozoïdes, une augmentation des anomalies morphologiques des spermatozoïdes, une augmentation de l’indice de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes, une altération de la fonction acrosomique des spermatozoïdes et même une altération du développement embryonnaire. Il s’agit d’une maladie andrologique courante dans la pratique clinique et l’une des causes importantes de l’infertilité masculine. Pour déterminer s’il existe une inflammation de l’appareil reproducteur masculin, les andrologues choisissent souvent d’examiner des cellules rondes ou de l’élastase plasmatique séminale dans le sperme comme base de diagnostic clinique. Cependant, l’examen des cellules rondes est facilement influencé par les cellules spermatogènes desquamées et les cellules épithéliales de l’appareil reproducteur, qui ne contribuent pas à réduire l’utilisation aveugle et inutile d’antibiotiques. Dans le même temps, le processus de détection de l’élastase est relativement compliqué, prend du temps et lent, ce qui n’est pas bénéfique pour le diagnostic précoce et le traitement de maladies telles que les infections de l’appareil génital masculin (MGTI). Nous avons appliqué de manière innovante l’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme assisté par un système d’analyse de sperme assisté par ordinateur (CASA) comme critère de diagnostic de la leucocytospermie, résolvant avec succès ces problèmes. Cet examen ne nécessite que l’ajout du fluide de fonctionnement composé de quatre réactifs dans l’échantillon, et le temps de réaction total à température ambiante peut être contrôlé en 20 à 30 minutes. Avec le frottis et l’examen microscopique qui s’ensuivent, la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase dans le sperme peut être obtenue en 60 minutes au total, ce qui peut être utilisé pour diagnostiquer si l’inflammation de l’appareil reproducteur masculin existait.
Introduction
L’infertilité est devenue un problème de santé publique mondial qui touche environ 15 % des couples en âge de procréer. Les facteurs masculins sont dus à environ 50 % des cas totaux d’hypofertilité, et près de 20 % à 30 % peuvent être attribués uniquement aux facteurs masculins 1,2,3. Les infections de l’appareil génital masculin constituent l’une des causes importantes d’infertilité masculine, représentant environ 15 % des cas 4,5.
La plupart des individus ont des leucocytes dans leur sperme, qui constituent 13 % des cellules non spermatozoïdes, avec des proportions différentielles de 12 % pour les neutrophiles, de 0,9 % pour les macrophages et de 0,1 % pour les lymphocytes6,7. Selon le manuel de laboratoire de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour l’examen et le traitement du sperme humain (5e éd.), la leucocytospermie est généralement définie comme la présence de leucocytes >1 ×10 6 cellules/mL dans le sperme8. Cette condition peut être causée par de nombreux facteurs tels que les toxines environnementales, la toxicomanie, les varicocèles, les MGTI, etc., tous susceptibles d’entraîner une augmentation anormale de la concentration de leucocytes dans le sperme9. Les leucocytes peuvent élever les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le sperme, provoquant une peroxydation lipidique et des dommages oxydatifs aux protéines et à l’ADN, ce qui entraîne une diminution de la motilité des spermatozoïdes, une augmentation des anomalies morphologiques des spermatozoïdes, un indice de fragmentation élevé de l’ADN des spermatozoïdes, une altération de la fonction acrosomique des spermatozoïdes et même des impacts négatifs sur le développement embryonnaire10,11.
Actuellement, les andrologues choisissent généralement d’examiner les cellules rondes du sperme ou de l’élastase dans le plasma séminal lors de l’identification de l’inflammation des voies génitales. Cependant, il est souvent difficile de distinguer les cellules spermatogènes desquamées et les cellules épithéliales de l’appareil reproducteur, qui ne contribuent pas à réduire l’utilisation aveugle et inutile d’antibiotiques6. Cette dernière méthode d’examen est relativement compliquée et prend beaucoup de temps, avec des résultats lents, ce qui n’est pas bénéfique pour le diagnostic précoce et le traitement de maladies telles que les MGTI. L’American Urological Association (AUA) suggère qu’une différenciation plus poussée entre les leucocytes et les cellules desquamées de l’appareil génital devrait être effectuée lorsque la concentration de cellules rondes dans l’analyse du sperme est supérieure à 1 × 106 cellules/mL12. Certains laboratoires d’andrologie utilisent la cytométrie en flux13 ou l’immunocytochimie de l’antigène leucocytaire (par exemple, CD45)14 pour examiner les leucocytes. Bien que ces méthodes soient précises, elles sont coûteuses et prennent beaucoup de temps, ce qui rend difficile la mise en œuvre clinique à grande échelle, en particulier dans les pays en développement.
La peroxydase est largement distribuée dans divers types de cellules et joue un rôle crucial dans la résistance aux dommages causés par le stress oxydatif. La myéloperoxydase (MPO) est un membre de la sous-famille des peroxydases qui est généralement exprimée dans les cellules immunitaires. Il est le plus fortement exprimé dans les granules azurophiles des neutrophiles15,16 et est également exprimé dans les lymphocytes17,18, les monocytes et les macrophages19. La concentration de leucocytes, en particulier de neutrophiles, dans le sperme peut être obtenue en examinant des cellules rondes qui sont peroxydases positives 7,20. Pour rendre le processus d’examen des leucocytes dans le sperme économique, pratique et efficace, nous avons repensé la méthode d’examen. À l’aide du système d’analyse de sperme assistée par ordinateur (CASA), la concentration de leucocytes peut être obtenue en 60 minutes. Cette nouvelle méthode permet de réduire les coûts d’examen des patients et le temps d’attente pour l’obtention des résultats, d’alléger la charge de travail des techniciens de laboratoire et de raccourcir la période d’attente du médecin pour le diagnostic et le traitement.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ortho-toluidine et le peroxyde d’hydrogène ont des propriétés photosensibles et peuvent se décomposer lorsqu’ils sont exposés à la lumière. Pour garantir l’efficacité des réactifs de test, il est recommandé de stocker le fluide de travail préparé dans un endroit sombre.
Les échantillons de sperme présentent naturellement des caractéristiques hétérogènes. Dans le processus de préparation des échantillons de sperme, il est crucial d’évaluer correctement l’éta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le laboratoire d’andrologie du Centre de médecine de la reproduction, le troisième hôpital affilié de l’Université Sun Yat-sen, d’avoir fourni les installations nécessaires à cette étude. Aucun financement n’a été impliqué dans la préparation de cet article.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
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