精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球の検査
Summary
この論文では、精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球を調べるための経済的で効率的なプロトコルを紹介します。コンピューター支援精液分析(CASA)システムの助けを借りて、精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球の濃度を合計60分以内に取得でき、アンドロロジーラボとアンドロロジストの効率を効果的に向上させます。
Abstract
白血球精子症は、精子の運動性の低下、精子の形態学的異常の増加、精子DNA断片化指数の上昇、精子先体機能の障害、さらには胚発生に影響を与える可能性があります。これは、臨床診療における一般的な男性性疾患であり、男性不妊症の重要な原因の1つです。男性の生殖器系炎症が存在するかどうかを判断する場合、アンドロロジストは、臨床診断の基礎として精液中の丸い細胞または精漿エラスターゼを調べることを選択することがよくあります。しかし、丸い細胞の検査は、剥がれた精子形成細胞および生殖管上皮細胞の影響を受けやすく、抗生物質の無差別かつ不必要な使用の減少に寄与しない。同時に、エラスターゼの検出プロセスは比較的複雑で時間がかかり、結果の報告に時間がかかるため、男性生殖器感染症(MGTI)などの疾患の早期診断や治療には有益ではありません。私たちは、コンピュータ支援精液分析(CASA)システムによる精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球の検査を白血球精子症の診断基準として革新的に適用し、これらの問題を解決することに成功しました。この検査は、4つの試薬からなる作動流体を検体に添加するだけで、室温での総反応時間は20〜30分以内に制御できます。その後の塗抹標本および顕微鏡検査により、精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球の濃度が合計60分以内に得られ、男性の生殖管の炎症が存在するかどうかを診断するために使用することができます。
Introduction
不妊症は、生殖年齢のカップルの約15%に影響を与える世界的な公衆衛生問題として浮上しています。男性要因は、不妊症全体の症例の約50%に寄与しており、ほぼ20%から30%は男性要因のみに起因する可能性があります1,2,3。男性生殖器感染症(MGTI)は、男性不妊症の重大な原因の1つであり、症例の約15%を占めています4,5。
ほとんどの個体は精液中に白血球を持ち、非精子細胞の13%を占め、好中球12%、マクロファージ0.9%、リンパ球0.1%の割合が異なります6,7。世界保健機関(WHO)のヒト精液の検査と処理に関する実験マニュアル(第5版)によると、白血球精子症は通常、精液中の>1×106細胞/ mLの白血球の存在として定義されます8。この状態は、環境毒素、薬物乱用、精索静脈瘤、MGTIなどの多くの要因によって引き起こされる可能性があり、すべてが精液中の白血球濃度の異常な増加につながる可能性があります9。白血球は精液中の活性酸素種(ROS)レベルを上昇させ、脂質過酸化とタンパク質とDNAへの酸化的損傷を引き起こし、精子の運動性の低下、精子の形態学的異常の増加、精子のDNA断片化指数の上昇、精子の先体機能の障害、さらには胚の発達への悪影響をもたらす可能性があります10,11。
現在、アンドロロジストは一般的に、生殖器の炎症を特定する際に、精液中の丸い細胞または精液中のエラスターゼを調べることを選択します。しかし、剥がれた精子形成細胞と生殖管上皮細胞を区別することはしばしば困難であり、抗生物質の無差別で不必要な使用を減らすことには寄与しません6。後者の検査方法は、比較的複雑で時間がかかり、結果の報告が遅いため、MGTIなどの疾患の早期診断と治療には有益ではありません。米国泌尿器科学会(AUA)は、精液分析における円形細胞濃度が1 ×10 6 細胞/mLを超える場合は、白血球と生殖管から剥がれた細胞をさらに分化する必要があると提案しています12。一部のアンドロロジーラボでは、フローサイトメトリー13 または白血球抗原(CD45など)免疫細胞化学14 を利用して白血球を検査しています。これらの方法は正確ですが、費用と時間がかかるため、特に発展途上国では大規模な臨床実装が困難です。
ペルオキシダーゼは様々な種類の細胞に広く分布しており、酸化ストレス損傷に対する耐性に重要な役割を果たしています。ミエロペルオキシダーゼ(MPO)は、一般的に免疫細胞に発現するペルオキシダーゼサブファミリーのメンバーです。好中球のアズロフィリック顆粒15,16で最も高発現し、リンパ球17,18、単球、マクロファージ19にも発現する。精液中の白血球、特に好中球の濃度は、ペルオキシダーゼ陽性の丸い細胞を調べることによって得ることができます7,20。精液中の白血球の検査プロセスを経済的、便利、かつ効率的にするために、検査方法を再設計しました。コンピューター支援精液分析(CASA)システムの助けを借りて、白血球の濃度を60分以内に取得できます。これにより、患者さんの検査費用や結果が出るまでの待ち時間が短縮され、検査技師の負担軽減や医師の診断・治療待ち時間の短縮が期待できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
オルトトルイジンと過酸化水素には感光性があり、光にさらされると分解する可能性があります。試験試薬の有効性を確保するために、調製した作動流体は暗い場所に保管することをお勧めします。
精液サンプルは自然に不均一な特性を示します。精液サンプルの調製プロセスでは、精液の液化状態を正しく判断し、各サンプリングの前に精液サンプルを完全に均質化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、本研究のための施設を提供してくれた中山大学第三附属病院生殖医療センターアンドロロジー研究室に感謝する。この記事の作成には資金は含まれていません。
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
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