정액에서 과산화효소 양성 백혈구 검사
Summary
이 논문은 정액에서 과산화효소 양성 백혈구를 검사하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템의 도움으로 정액의 과산화효소 양성 백혈구 농도를 총 60분 이내에 얻을 수 있어 남성학 실험실 및 남성학자의 효율성을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.
Abstract
백혈구 정자증은 정자 운동성 감소, 정자 형태학적 이상 증가, 정자 DNA 단편화 지수 증가, 정자 아크로솜 기능 손상, 심지어 배아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 임상에서 흔히 볼 수 있는 남성학적 질환이며 남성 불임의 중요한 원인 중 하나입니다. 남성 생식기 염증의 존재 여부를 결정할 때, 남성의학 전문의는 종종 임상 진단 근거로 정액의 원형 세포 또는 정액 혈장 엘라스타제를 검사합니다. 그러나 원형 세포의 검사는 무분별하고 불필요한 항생제 사용을 줄이는 데 기여하지 않는 정자 생성 세포와 생식관 상피 세포에 의해 쉽게 영향을 받습니다. 동시에 엘라스타제의 검출 과정은 상대적으로 복잡하고 시간이 많이 걸리며 결과 보고가 느리기 때문에 남성 생식기 감염(MGTI)과 같은 질병의 조기 진단 및 치료에 도움이 되지 않습니다. 백혈구 정자증의 진단 기준으로 CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템을 통해 정액에서 과산화효소 양성 백혈구 검사를 혁신적으로 적용하여 이러한 문제를 성공적으로 해결하였습니다. 이 검사는 4개의 시약으로 구성된 사용 유체를 시료에 추가하기만 하면 되며 실온에서의 총 반응 시간은 20-30분 이내에 제어할 수 있습니다. 후속 도말 및 현미경 검사를 통해 총 60분 이내에 정액 내 과산화효소 양성 백혈구 농도를 얻을 수 있으며, 이는 남성 생식관의 염증 존재 여부를 진단하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
불임은 가임기 부부의 약 15%에 영향을 미치는 글로벌 공중 보건 문제로 부상했습니다. 전체 난임 사례의 약 50%가 남성 요인에 기인하며, 거의 20%에서 30%는 남성 요인에 기인할 수 있다 1,2,3. 남성 생식기 감염(MGTI)은 남성 불임의 중요한 원인 중 하나로, 전체 불임 사례의 약 15%를 차지한다 4,5.
대부분의 개인은 정액에 백혈구를 가지고 있으며, 이는 비정자 세포의 13%를 구성하며, 호중구 12%, 대식세포 0.9%, 림프구 0.1%6,7의 차등 비율이 있습니다. 세계보건기구(WHO)의 인간 정액 검사 및 처리 실험실 매뉴얼(5판)에 따르면, 백혈구 정자증은 일반적으로 정액에 >1 × 106 cells/mL 백혈구가 존재하는 것으로 정의된다8. 이 질환은 환경 독소, 약물 남용, 정맥류, MGTI 등과 같은 다양한 요인에 의해 발생할 수 있으며, 이 모든 요인은 정액 내 백혈구 농도의 비정상적인 증가로 이어질 수 있다9. 백혈구는 정액의 활성산소종(ROS) 수치를 높여 단백질과 DNA에 지질 과산화 및 산화적 손상을 일으켜 정자 운동성 감소, 정자 형태학적 이상 증가, 정자 DNA 단편화 지수 상승, 정자 아크로솜 기능 손상, 심지어 배아 발달에 부정적인 영향을 미칠 수 있다10,11.
현재 남성의학 전문의들은 생식기 염증을 확인할 때 정액의 둥근 세포나 정액 혈장의 엘라스타제를 검사하는 것이 일반적입니다. 그러나 무분별하고 불필요한 항생제 사용을 줄이는 데 기여하지 않는 정자 생성 세포와 생식관 상피 세포를 구별하는 것은 종종 어렵다6. 후자의 검사 방법은 상대적으로 복잡하고 시간이 많이 걸리며 결과 보고가 느리기 때문에 MGTI와 같은 질병의 조기 진단 및 치료에 도움이 되지 않습니다. 미국 비뇨기과학회(American Urological Association, AUA)는 정액 분석에서 원형 세포 농도가 1 × 106 cells/mL12 이상일 때 생식기에서 백혈구와 축출된 세포를 추가로 구별해야 한다고 제안한다. 일부 남성학 실험실에서는 백혈구를 검사하기 위해 유세포 분석(flow cytometry)13 또는 백혈구 항원(le-g., CD45) 면역세포화학(immunocytochemistry)14 을 이용한다. 이러한 방법은 정확하지만 비용과 시간이 많이 소요되어 특히 개발도상국에서 대규모 임상 구현이 어렵습니다.
과산화효소는 다양한 유형의 세포에 널리 분포되어 있으며 산화 스트레스 손상에 대한 저항력에 중요한 역할을 합니다. 골수화효소(MPO)는 일반적으로 면역 세포에서 발현되는 과산화효소 아과(subfamily)의 구성원입니다. 호중구의 azurophilic granules 15,16에서 가장 많이 발현되며 림프구 17,18, monocyte 및 macrophage 19에서도 발현됩니다. 정액에서 백혈구, 특히 호중구의 농도는 과산화효소 양성 7,20인 둥근 세포를 검사하여 얻을 수 있습니다. 정액 내 백혈구 검사 과정을 경제적이고 편리하며 효율적으로 만들기 위해 검사 방법을 재설계했습니다. CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) 시스템의 도움을 받아 60분 이내에 백혈구 농도를 얻을 수 있습니다. 이 새로운 방법은 환자의 검사 비용과 결과를 얻기 위한 대기 시간을 줄이고 실험실 기술자의 작업량을 줄이며 의사의 진단 및 치료 대기 시간을 단축합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오르토톨루이딘과 과산화수소는 감광성을 가지며 빛에 노출되면 분해될 수 있습니다. 테스트 시약의 효과를 보장하려면 준비된 작동 유체를 어두운 곳에 보관하는 것이 좋습니다.
정액 샘플은 자연적으로 이질적인 특성을 나타냅니다. 정액 샘플의 준비 과정에서 정액의 액화 상태를 정확하게 판단하고 각 샘플링 전에 정액 샘플을 완전히 균질화하는 것은 테스트 결과의 신?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 연구를 위한 시설을 제공한 Sun Yat-sen University의 제3 부속 병원인 Center for Reproductive Medicine의 Andrology Laboratory에 감사드립니다. 이 기사를 준비하는 데 자금이 투입되지 않았습니다.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
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