Исследование пероксидаз-положительных лейкоцитов в сперме
Summary
В данной работе представлен экономичный и эффективный протокол исследования пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме. С помощью системы автоматизированного анализа спермы (CASA) можно получить концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме в течение 60 минут, эффективно повышая эффективность работы андрологической лаборатории и андрологов.
Abstract
Лейкоцитоспермия может привести к снижению подвижности сперматозоидов, увеличению морфологических аномалий сперматозоидов, повышению индекса фрагментации ДНК сперматозоидов, нарушению функции акросом сперматозоидов и даже к нарушению эмбрионального развития. Это распространенное андрологическое заболевание в клинической практике и одна из важных причин мужского бесплодия. При определении наличия воспаления мужского репродуктивного тракта андрологи часто выбирают исследование круглых клеток или семенной плазменной эластазы в сперме в качестве клинико-диагностической основы. Однако на исследование круглых клеток легко влияют отшелушивающиеся сперматогенные клетки и эпителиальные клетки репродуктивного тракта, которые не способствуют уменьшению беспорядочного и ненужного применения антибиотиков. В то же время процесс обнаружения эластазы является относительно сложным, трудоемким и медленным в получении результатов, что не способствует ранней диагностике и лечению таких заболеваний, как инфекции мужских половых путей (МГТИ). Мы инновационно применили исследование пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме с помощью системы компьютерного анализа спермы (CASA) в качестве диагностического критерия лейкоцитоспермии, успешно решив эти проблемы. Это исследование требует только добавления рабочей жидкости, состоящей из четырех реагентов, в образец, а общее время реакции при комнатной температуре можно контролировать в течение 20-30 минут. При последующем мазке и микроскопическом исследовании можно получить концентрацию пероксидазоположительных лейкоцитов в сперме в общей сложности в течение 60 мин, что может быть использовано для диагностики наличия воспаления мужских половых путей.
Introduction
Бесплодие стало глобальной проблемой общественного здравоохранения, затрагивающей примерно 15% пар в репродуктивном возрасте. Мужские факторы составляют около 50% от общего числа случаев субфертильности, и почти 20-30% могут быть отнесены исключительно к мужским факторам 1,2,3. Инфекции мужских половых путей (МГТИ) являются одной из значимых причин мужского бесплодия, составляя около 15% случаев 4,5.
У большинства людей лейкоциты в сперме составляют 13% несперматозоидных клеток, с дифференциальными пропорциями: нейтрофилы 12%, макрофаги 0,9% и лимфоциты 0,1%6,7. Согласно лабораторному руководству Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по исследованию и обработке спермы человека (5-е изд.), лейкоцитоспермия обычно определяется как наличие >1 × 106 клеток/мл лейкоцитов в сперме8. Это состояние может быть вызвано многочисленными факторами, такими как токсины окружающей среды, злоупотребление психоактивными веществами, варикоцеле, MGTI и т. д., которые потенциально могут привести к аномальному увеличению концентрации лейкоцитов в сперме9. Лейкоциты могут повышать уровень активных форм кислорода (АФК) в сперме, вызывая перекисное окисление липидов и окислительное повреждение белка и ДНК, что приводит к снижению подвижности сперматозоидов, увеличению морфологических аномалий сперматозоидов, повышению индекса фрагментации ДНК сперматозоидов, нарушению функции акросом сперматозоидов и даже негативному влиянию на развитие эмбриона10,11.
В настоящее время андрологи обычно выбирают исследование круглых клеток в сперме или эластазы в семенной плазме при выявлении воспаления половых путей. Тем не менее, часто бывает сложно отличить отшелушивающиеся сперматогенные клетки от эпителиальных клеток репродуктивного тракта, которые не способствуют сокращению беспорядочного и ненужного использования антибиотиков6. Последний метод обследования является относительно сложным и трудоемким, с медленным получением результатов, что не способствует ранней диагностике и лечению таких заболеваний, как MGTI. Американская урологическая ассоциация (AUA) предлагает проводить дальнейшую дифференциацию между лейкоцитами и отшелушенными клетками из половых путей, когда концентрация круглых клеток в спермограмме превышает 1 × 106 клеток/мл12. Некоторые андрологические лаборатории используют проточную цитометрию13 или иммуноцитохимию лейкоцитарного антигена (например, CD45)14 для исследования лейкоцитов. Несмотря на то, что эти методы являются точными, они являются дорогостоящими и трудоемкими, что затрудняет их широкомасштабное клиническое внедрение, особенно в развивающихся странах.
Пероксидаза широко распространена в различных типах клеток и играет решающую роль в устойчивости к окислительному стрессу. Миелопероксидаза (МПО) является членом подсемейства пероксидаза, которое обычно экспрессируется в иммунных клетках. Он наиболее высоко экспрессируется в азурофильных гранулах нейтрофилов15,16, а также в лимфоцитах17,18, моноцитах и макрофагах19. Концентрацию лейкоцитов, особенно нейтрофилов, в сперме можно получить, исследуя круглые клетки, которые являются пероксидазоположительными 7,20. Чтобы сделать процесс исследования лейкоцитов в сперме экономичным, удобным и эффективным, мы модернизировали метод исследования. С помощью системы компьютерного анализа спермы (CASA) концентрация лейкоцитов может быть получена в течение 60 минут. Этот новый метод снижает затраты на обследование пациентов и время ожидания получения результатов, снижает нагрузку на лаборантов, сокращает время ожидания диагноза и лечения у врача.
Protocol
Representative Results
Discussion
Орто-толуидин и перекись водорода обладают светочувствительными свойствами и могут разлагаться под воздействием света. Для обеспечения эффективности испытуемых реагентов приготовленную рабочую жидкость рекомендуется хранить в темном месте.
Образцы спермы, естестве?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Андрологической лаборатории Центра репродуктивной медицины, Третьей филиальной больницы Университета Сунь Ятсена, за предоставление возможностей для проведения данного исследования. Никакого финансирования на подготовку этой статьи не было.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
