Semende Peroksidaz Pozitif Lökositlerin İncelenmesi
Summary
Bu makale, menide peroksidaz pozitif lökositlerin incelenmesi için ekonomik ve etkili bir protokol sunmaktadır. Bilgisayar destekli semen analizi (CASA) sisteminin yardımıyla, spermdeki peroksidaz pozitif lökosit konsantrasyonu toplam 60 dakika içinde elde edilebilir ve bu da androloji laboratuvarının ve andrologların verimliliğini etkili bir şekilde artırır.
Abstract
Lökositospermi, spermatozoa motilitesinin azalmasına, spermatozoa morfolojik anormalliklerinin artmasına, spermatozoa DNA fragmantasyon indeksinin yükselmesine, spermatozoa akrozom fonksiyonunun bozulmasına ve hatta embriyonik gelişimin etkilenmesine neden olabilir. Klinik pratikte sık görülen bir androlojik hastalıktır ve erkek infertilitesinin önemli nedenlerinden biridir. Erkek üreme sistemi iltihabının var olup olmadığını belirlerken, androloglar genellikle klinik tanı temeli olarak menideki yuvarlak hücreleri veya seminal plazma elastazını incelemeyi seçerler. Bununla birlikte, yuvarlak hücrelerin incelenmesi, ayrım gözetmeyen ve gereksiz antibiyotik kullanımının azaltılmasına katkıda bulunmayan soyulmuş spermatojenik hücreler ve üreme sistemi epitel hücrelerinden kolayca etkilenir. Aynı zamanda, elastazın tespit süreci nispeten karmaşık, zaman alıcı ve sonuçların raporlanmasında yavaştır, bu da erkek genital sistem enfeksiyonları (MGTI’ler) gibi hastalıkların erken tanı ve tedavisi için faydalı değildir. Lökositospermi için bir tanı kriteri olarak bilgisayar destekli semen analizi (CASA) sistemi destekli semende peroksidaz pozitif lökositlerin incelenmesini yenilikçi bir şekilde uyguladık ve bu sorunları başarıyla çözdük. Bu inceleme sadece numuneye dört reaktiften oluşan çalışma sıvısının eklenmesini gerektirir ve oda sıcaklığında toplam reaksiyon süresi 20-30 dakika içinde kontrol edilebilir. Daha sonraki smear ve mikroskobik inceleme ile, menideki peroksidaz pozitif lökosit konsantrasyonu toplam 60 dakika içinde elde edilebilir ve bu da erkek üreme sistemi iltihabının var olup olmadığını teşhis etmek için kullanılabilir.
Introduction
Kısırlık, üreme çağındaki çiftlerin yaklaşık %15’ini etkileyen küresel bir halk sağlığı sorunu olarak ortaya çıkmıştır. Erkek faktörleri, toplam subfertilite vakalarının yaklaşık% 50’sinden etkilenir ve yaklaşık% 20 ila% 30’u yalnızca erkek faktörlerine atfedilebilir 1,2,3. Erkek genital sistem enfeksiyonları (MGTI’ler), erkek infertilitesinin önemli nedenlerinden birini oluşturur ve vakaların yaklaşık %15’ini oluşturur 4,5.
Çoğu bireyin menisinde spermatozoan olmayan hücrelerin %13’ünü oluşturan lökositler bulunur, diferansiyel oranlar nötrofiller %12, makrofajlar %0,9 ve lenfositler %0,1’dir6,7. İnsan sperminin incelenmesi ve işlenmesi için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) laboratuvar kılavuzuna göre (5. baskı), lökositospermi genellikle menide >1 × 106 hücre / mL lökosit varlığı olarak tanımlanır8. Bu durum, çevresel toksinler, madde bağımlılığı, varikoseller, MGTI’ler vb. gibi çok sayıda faktörden kaynaklanabilir ve bunların tümü potansiyel olarak semen9’daki lökosit konsantrasyonunda anormal bir artışa yol açabilir. Lökositler, menideki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerini yükseltebilir, lipid peroksidasyonuna ve protein ve DNA’da oksidatif hasara neden olabilir, bu da spermatozoa motilitesinin azalmasına, spermatozoa morfolojik anormalliklerinin artmasına, spermatozoa DNA fragmantasyon indeksinin yükselmesine, spermatozoa akrozom fonksiyonunun bozulmasına ve hatta embriyo gelişimi üzerinde olumsuz etkilere neden olabilir10,11.
Şu anda, androloglar genital sistem iltihabını tanımlarken genellikle menideki yuvarlak hücreleri veya seminal plazmadaki elastazı incelemeyi tercih etmektedirler. Bununla birlikte, ayrım gözetmeyen ve gereksiz antibiyotik kullanımının azaltılmasına katkıda bulunmayan soyulmuş spermatojenik hücreleri ve üreme sistemi epitel hücrelerini ayırt etmek genellikle zordur6. İkinci muayene yöntemi, MGTI’ler gibi hastalıkların erken tanı ve tedavisi için faydalı olmayan, yavaş sonuç raporlaması ile nispeten karmaşık ve zaman alıcıdır. Amerikan Üroloji Derneği (AUA), semen analizindeki yuvarlak hücre konsantrasyonu 1 × 106 hücre / mL12’den büyük olduğunda, lökositler ve genital sistemden dökülmüş hücreler arasında daha fazla ayrım yapılması gerektiğini önermektedir. Bazı androloji laboratuvarları, lökositleri incelemek için akış sitometrisi13 veya lökosit antijeni (örneğin, CD45) immünositokimyası14’ü kullanır. Bu yöntemler kesin olmakla birlikte, pahalı ve zaman alıcıdır, bu da özellikle gelişmekte olan ülkelerde büyük ölçekli klinik uygulamayı zorlaştırır.
Peroksidaz, çeşitli hücre tiplerinde yaygın olarak bulunur ve oksidatif stres hasarına karşı dirençte çok önemli bir rol oynar. Miyeloperoksidaz (MPO), genellikle bağışıklık hücrelerinde eksprese edilen peroksidaz alt ailesinin bir üyesidir. En yüksek oranda nötrofillerin azurofilik granüllerinde15,16 eksprese edilir ve ayrıca lenfositlerde17,18, monositlerde ve makrofajlarda19 eksprese edilir. Semende lökositlerin, özellikle nötrofillerin konsantrasyonu, peroksidaz pozitif olan yuvarlak hücrelerin incelenmesiyle elde edilebilir 7,20. Semendeki lökositlerin inceleme sürecini ekonomik, kullanışlı ve verimli hale getirmek için inceleme yöntemini yeniden tasarladık. Bilgisayar destekli semen analizi (CASA) sistemi tarafından desteklenen lökosit konsantrasyonu 60 dakika içinde elde edilebilir. Bu yeni yöntem, hastaların muayene masraflarını ve sonuç almak için bekleme süresini azaltmakta, laboratuvar teknisyenlerinin iş yükünü hafifletmekte, doktorun tanı ve tedavi bekleme süresini kısaltmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Orto-toluidin ve hidrojen peroksit ışığa duyarlı özelliklere sahiptir ve ışığa maruz kaldığında ayrışabilir. Test reaktiflerinin etkinliğini sağlamak için, hazırlanan çalışma sıvısının karanlık bir yerde saklanması önerilir.
Semen örnekleri doğal olarak heterojen özellikler sergiler. Semen örneklerinin hazırlanması sürecinde, spermin sıvılaşma durumunun doğru bir şekilde değerlendirilmesi ve her örneklemeden önce semen örneklerinin iyice homojenle?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Sun Yat-sen Üniversitesi’nin Üçüncü Bağlı Hastanesi olan Üreme Tıbbı Merkezi Androloji Laboratuvarı’na bu çalışma için olanaklar sağladığı için minnettardır. Bu makalenin hazırlanmasında herhangi bir fon bulunmamıştır.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
