Kvantificering af autoreaktive antistoffer hos mus ved eksperimentel autoimmun encephalomyelitis
Summary
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en dyremodel af multipel sklerose (MS), som deler med den menneskelige sygdom et robust humoralt autoimmun respons. Her rapporterer vi en enkel og fleksibel ELISA-protokol til kvantificering af autoantistoffer i serum fra EAE-immuniserede mus.
Abstract
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en sygdomsmodel, der rekapitulerer den autoimmune lidelse multipel sklerose (MS) på histopatologisk og molekylært niveau. EAE induceres ved immunisering af forsøgsdyr via subkutan injektion af korte myelinpeptider sammen med specifikke adjuvanser for at øge immunresponset. Ligesom den menneskelige modstykke udvikler EAE-mus demyeliniserende læsioner, immuncelleinfiltration i centralnervesystemet (CNS), gliaaktivering og neuronal skade. En konsistent mængde beviser understøtter også en mekanistisk rolle for B-celledysfunktion i ætiologien af både MS og EAE. B-celler kan tjene som antigenpræsenterende celler såvel som en primær kilde til proinflammatoriske cytokiner og autoantistoffer. I EAE genereres antistoffer mod myelinpeptiderne, der blev anvendt til at fremkalde sygdommen. Sådanne autoantistoffer har vist sig at mediere enten myelintab eller patogen T-celle reaktivering i CNS. Denne artikel beskriver en effektiv ELISA-baseret protokol til kvantificering af autoantistoffer i serum fra C57BL/6J-mus, der er immuniseret med myelinoligodendrocytglycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptidet. Den foreslåede metode tjener som et kraftfuldt værktøj til at undersøge specificiteten og størrelsen af det afvigende humorale respons i forbindelse med autoimmun demyelinisering.
Introduction
Multipel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) karakteriseret ved fokal infiltration af immunceller i hjernens parenchyma, nedbrydning af myelinskeder, indpakning af axoner, gliaaktivering og neuronalt tab1. Ud over den veletablerede rolle patogene T-celler har flere bevislinjer fremhævet involveringen af B-celler i formidling af det autoimmune respons mod CNS. B-celler gennemgår klonal ekspansion i MS-hjernen, og antistoffer mod myelinkomponenter er blevet påvist i demyelinerede læsioner 2,3. Den selektive aktivering af perifere B-celler ved sygdomsdebut er for nylig blevet dokumenteret, hvilket tyder på en formodet rolle for dette immuncellerum også i sygdomsinitiering4. Succesen med B-cellenedbrydende terapier såsom anti-CD20 monoklonale antistoffer bekræfter yderligere den mekanistiske forbindelse mellem afvigende B-cellefunktion og autoimmun demyelinering 5,6. Fra et molekylært synspunkt kan B-celler bidrage til sygdom via autoantigenpræsentation, proinflammatorisk cytokinsekretion og autoreaktiv antistofproduktion.
Flere dyremodeller er blevet udviklet til at rekapitulere specifikke træk ved den komplekse MS-fænotype. Blandt dem er eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) det mest anvendte in vivo-paradigme og er afhængig af immunisering af forsøgsdyr med korte peptider afledt af myelinproteiner, såsom myelinoligodendrocytglycoprotein (MOG) og myelinbasisk protein (MBP)7. EAE-immuniserede dyr udvikler en demyeliniserende patologi, der ligner MS i mange aspekter, herunder et robust humoralt respons mod det encephalitogene peptid8. Af denne grund har EAE-undersøgelser været medvirkende til at dissekere funktionen af B-celler og autoantistoffer i forbindelse med sygdom. For eksempel blev det påvist, at MOG-specifikke antistoffer isoleret fra MS-patienter kan forværre det kliniske forløb i EAE-modeller9. Især blev prolinresten i position 42 i human MOG vist at være kritisk til bestemmelse af autoantistofpatogenicitet10. For nylig har MOG-specifikke autoantistoffer vist sig at fremme sygdom ikke kun ved at formidle myelintab, men også ved at øge reaktiveringen af autoreaktive T-celler i CNS11.
I betragtning af vigtigheden af antistofresponser i CNS-autoimmunitet præsenterer denne artikel en ELISA-baseret protokol til effektivt at måle serumniveauerne af autoreaktive antistoffer i C57BL/6J-mus EAE immuniseret med MOG35-55-peptid. I den første del af protokollen beskrives metoden til opsamling af serum via intrakardial punktering. Derefter vil procedurerne for oprettelse af ELISA-analysen og erhvervelse af dataene blive detaljeret. Endelig vil dataanalyse og fortolkning blive diskuteret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her blev en enkel og effektiv ELISA-baseret protokol rapporteret for nøjagtigt at kvantificere det humorale respons i en relevant dyremodel af MS-patologi. Denne metode er for nylig blevet anvendt til at beskrive den nye rolle af ataxin-1-proteinet i at kontrollere serumniveauerne af autoantistoffer i MOG35-55 / C57BL6J EAE-paradigme12. I den forbindelse bør der tages hensyn til en række faktorer for at opnå konsistente og biologisk meningsfulde resultater med denne metode.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (R03NS131908) og Department of Defense gennem Multiple Sclerosis Research Program under Award No. W81XWH-22-1-0517. Udtalelser, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger er forfatterens og er ikke nødvendigvis godkendt af forsvarsministeriet. Denne undersøgelse blev også støttet af East Carolina University opstartsfonde.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
