Protokollen beskriver håret rodinduktion ved hjælp af Arabidopsis primære blomsterstængler og Brassica napus hypocotyls. De hårede rødder kan dyrkes og bruges som explants til at regenerere transgene planter.
Behåret rodtransformation repræsenterer et alsidigt værktøj til plantebioteknologi i forskellige arter. Infektion med en Agrobacterium-stamme , der bærer et rodinducerende (Ri) plasmid, inducerer dannelsen af hårede rødder på sårstedet efter overførsel af T-DNA fra Ri-plasmidet til plantegenomet. Protokollen beskriver detaljeret proceduren for injektionsbaseret hårrodsinduktion i Brassica napus DH12075 og Arabidopsis thaliana Col-0. De hårede rødder kan bruges til at analysere et transgen af interesse eller behandles til generering af transgene planter. Regenereringsmedium indeholdende cytokinin 6-benzylaminoturin (5 mg / l) og auxin 1-naphthaleneddikesyre (8 mg / l) fremkalder med succes skuddannelse i begge arter. Protokollen omfatter genotypebestemmelse og udvælgelse af regeneranter og T1-planter for at opnå planter, der bærer et transgen af interesse og fri for T-DNA fra Ri-plasmidet. En alternativ proces, der fører til dannelsen af en sammensat plante, er også afbildet. I dette tilfælde holdes hårede rødder på skuddet (i stedet for de naturlige rødder), hvilket muliggør undersøgelse af et transgen i hårede rodkulturer i sammenhæng med hele planten.
Plantetransformation er flaskehalsen for enhver genetisk undersøgelse inden for plantebiologi. En jordbåren bakterie, Agrobacterium tumefaciens, anvendes i vid udstrækning som et middel til genlevering ved blomsterdip eller vævskultur til at generere transformanter. A. tumefaciens inficerer planter på et sårsted og forårsager tumorer på grund af overførsel og integration af T-DNA fra et tumorinducerende (Ti) plasmid i værtsplantegenomet. Manipulerede A. tumefaciens-stammer med modificeret Ti-plasmid uden vildtype T-DNA og en binær vektor med kunstigt T-DNA og kloningssteder til indsættelse af et gen af interesse anvendes almindeligvis som et effektivt plantetransformationssystem1. Imidlertid er mange modelarter og afgrøder genstridige over for blomsterdip eller in vitro plantegenerering eller har lange vækstcyklusser, hvilket påvirker effektiviteten af dette transformationssystem.
Agrobacterium rhizogenes inducerer dannelsen af utilsigtede rødder eller hårede rødder på sårstedet efter infektion af en værtsplante. I lighed med A. tumefaciens overfører A. rhizogenes et T-DNA fra et rodinducerende (Ri) plasmid til værtsplantegenomet, hvilket forårsager udvikling af transgene hårede rødder. Denne proces styres hovedsageligt af rodonkogene loci (rol) gener 2,3. Ved hjælp af agrobakterielle stammer, der bærer både Ri-plasmidet og en kunstig binær vektor, der koder for et gen af interesse, er hårede rodkulturer blevet brugt til at producere rekombinante proteiner, analysere funktionen af promotorer eller gener eller redigere genomer ved hjælp af Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRS) / CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) 4,5,6.
Vores protokol bruger den transkonjugante stamme Ti-less A. tumefaciens C58C1, der bærer Ri-plasmidet pRiA4b7. Ri-plasmidets T-DNA består af to regioner, højre og venstre T-DNA (HENHOLDSVIS TR-DNA og TL-DNA), der uafhængigt kan integreres i plantegenomet8. Ved at udnytte dette system blev den langvarige explant-transformationsproces i Brassica napus DH12075 sort optimeret9. Protokollen beskrevet nedenfor giver mulighed for regenerering af udvalgte hårede rodlinjer og opnåelse af T1-planter, der bærer transgenet af interesse og fri for rolgener på cirka 1 år. Den injektionsbaserede hårede rodtransformation kan bruges i andre Brassicaceae-arter, som vist ved at transformere Arabidopsis thaliana Col-0. Mens hypocotyl bruges til at omdanne B. napus, injiceres A. thaliana i den primære blomsterstandstamme.
Vi udviklede en simpel protokol til hårrodstransformation og efterfølgende regenerering i B. napus og A. thaliana. Denne proces omfatter injektionsbaseret håret rodinduktion i hypocotyl (B. napus) eller primær blomsterstandstamme (A. thaliana). Metoden til injektion af hypocotyl med agrobakteriel stamme C58C1, der bærer et Ri-plasmid, var også effektiv i Fabaceae-familien10,11 ud over medlemmerne af Brassicaceae, der blev præsenteret i denne undersøgelse.
Et alternativ til den injektionsbaserede metode er den nedsænkningsbaserede transformation bestående af explant nedsænkning i en bakteriel suspension efterfulgt af co-dyrkning af explant med agrobakterier. Fordelen ved den injektionsbaserede metode i forhold til nedsænkningsmetoden er den tid, der spares ved fraværet af nogle protokoltrin: explantageforberedelse, en test af samdyrkningstiden og dyrkning på et medium indeholdende hormon til induktion af hårede rødder. Selvom begge tilgange er effektive til hårrodsinduktion, blev der observeret højere transformationseffektivitet hos nogle arter med den injektionsbaserede metode sammenlignet med explant-nedsænkningen en12,13. Desuden er injektionsbaseret transformation også nyttig til generering af sammensatte planter (transgene hårede rødder og vildtypeskud). Efter at have afskåret de oprindelige rødder af den transformerede plante, understøtter hårede rødder plantevæksten, og transgenet kan studeres i sammenhæng med hele planten.
Det kritiske trin i håret rodinduktion injicerer inokulum i hypocotyl eller primær blomsterstandstamme. Hypocotyls af B. napus er brudbare, og skære hele hypocotyl kan let ske. Det samme kan observeres med A. thaliana på grund af blomsterstandens stamme tyndhed. Hvis der kræves en sammenligning af forskellige arters/sorters transformationseffektivitet, anbefaler vi, at én person udfører alle forsøg for at undgå fejl forårsaget af manipulation og dygtighed til injektion af planterne.
Vi udviklede en effektiv protokol til hårrodsregenerering i B. napus DH12075 og A. thaliana Col-0. Da regenerering er en meget variabel proces, kan nogle protokolændringer anvendes på en art eller sort efter eget valg. For eksempel kan de hårede rodafledte skud fremkaldes af et andet auxin / cytokininforhold (1: 1) i B. oleracea14. Alternativt kan cytokinin thidiazuron anvendes i stedet for BAP, såsom i tilfælde af B. campestris hårede rødder15.
Flere indsættelser af Ri-plasmidet T-DNA i plantegenomet repræsenterer en potentiel begrænsning af det hårede rodtransformations- og regenereringssystem. I sådanne tilfælde afdækkes ingen planter, der er fri for TL / TR fra Ri-plasmidet efter en adskillelsesanalyse af T1-frøplanter. Derfor anbefaler vi at generere flere uafhængige hårede rodlinjer for hvert transgen.
Behårede rodkulturer er et ekstremt kraftfuldt værktøj til genfunktionelle undersøgelser, hovedsageligt på grund af deres hurtige etablering og billige vedligeholdelse (ingen hormoner er nødvendige i dyrkningsmedier). Denne protokol dækker metoderne til induktion og regenerering af hårrødder i B. napus og A. thaliana, som kan bruges til at studere transgenet af interesse direkte i hårede rodkulturer, i forbindelse med hele planten ved hjælp af sammensatte planter eller efter regenerering af de transgene planter.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Jiří Macas (Biology Centre CAS, České Budějovice, Tjekkiet) for at levere den agrobakterielle stamme. Core Facility Plants Sciences of CEITEC MU er anerkendt for sin tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Tjekkiets ministerium for uddannelse, ungdom og sport med Den Europæiske Fond for Regionaludviklings projekt “SINGING PLANT” (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) og INTER-COST-projektet LTC20004.
1.50 mL tubes | Eppendorf | 125.215 | |
10% solution of commercial bleach | SAVO | ||
1-naphthaleneacetic acid (NAA) | Duchefa | N0903 | Callus regeneration medium |
2.0 mL tubes | Eppendorf | 108.132/108.078 | |
3M micropore tape | Micropore | ||
6-Benzylaminopurine (BAP) | Duchefa | B0904 | Callus regeneration medium, Shoot elongation medium |
70% ethanol | |||
bacteriological agar | HiMedia | RM201 | LB medium |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | LB and YEB media |
Beef extract | Roth | X975.1 | YEB medium |
Bottles | DURAN | L300025 | |
Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
chloroform | Serva | 3955301 | |
CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide | Sigma | 52365 | |
dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | R0193 | |
EDTA – Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma | ES134-250G | |
elctroporation cuvette | |||
electrophesis agar, peqGOLD universal | VWR | 732-2789 | |
electrophoresis chamber | BIO-RAD | ||
electrophoresis gel reader | BIO-RAD | ||
electroporator GenePulser Xcell | BIO-RAD | ||
ethidium bromide | AppliChem | ||
Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap | BIO-RAD | 1652082 | |
Gene Ruler DNA ladder mix | Thermo Fisher Scientific | SM0331 | |
Gibberellic acid (GA3) | Duchefa | G0907 | Shoot elongation medium |
glycerol | Sigma | G5516-1L | |
HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique | Merck | 1101100250 | |
indole-3-butyric acid (IBA) | Duchefa | I0902 | Root induction medium |
kanamycin monosulfate | Duchefa | K0126 | |
Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid | Plant Media | V8505-100 | |
Measuring cylinder | |||
MES monohydrate | Duchefa | M1503 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
Murashige and Skoog medium (MS) | Duchefa | M0237 | Medium for germination, Plant growing medium |
Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins | Duchefa | M0231 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium |
needle Agani 26G x 1/2 – 0.45 x 13mm | Terumo | ||
pH meter | |||
Phytagel | Sigma | P8169 | Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination |
PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000) | Sigma | 9003-39-8 | |
Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included | Sigma | D4309-250UN | |
Retsh mill | Qiagen | ||
sodium chloride | Lachner | 30093-APO | LB medium |
square Petri Dishes | Corning | GOSSBP124-05 | |
sucrose | Penta | 24970-31000 | Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium |
Syringe filter | Carl Roth | P666.1 | Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size |
thermomixer | Eppendorf | ||
Ticarcillin disodium | Duchefa | T0180 | Hairy root growing medium |
Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Serva | 3719003 | |
ultrapure water | Millipore Milli-Q purified water | ||
Yeast extract | Duchefa | Y1333 | LB medium |