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Summary

이 프로토콜은 멸종 위기에 처한 산호 종의 정자 처리 및 냉동 보존의 효율성과 용량을 개선하기 위한 반자동 경로를 설명하여 유전적 다양성을 확보하고 산호초 복원 노력을 지원하는 것을 목표로 합니다.

Abstract

산호초는 해양 온난화로 인한 백화 현상의 빈도가 증가하여 전 세계 산호초의 산호가 죽음에 따라 위기에 직면해 있습니다. 그에 따른 유전적 다양성과 생물 다양성의 손실은 산호가 기후 변화에 적응하는 능력을 감소시킬 수 있으므로 현재와 미래의 산호초 복원에 사용할 수 있는 자원을 최대화하기 위해서는 기존 다양성을 보존하기 위한 노력이 필수적입니다. 유전학을 장기적으로 확보하는 가장 효과적인 방법은 냉동 보존 및 바이오 뱅킹으로, 액체 질소에서 살아있는 샘플을 극저온으로 무기한 냉동 보관할 수 있습니다. 산호 정자의 냉동 보존은 2012년부터 가능했지만, 산호 번식의 계절적 특성으로 인해 바이오뱅킹 활동은 산란이 발생하는 연간 며칠 밤으로 제한됩니다. 따라서 산호 정자 처리 및 냉동 보존 워크플로우의 효율성을 개선하는 것은 이러한 제한된 바이오뱅킹 기회를 극대화하는 데 필수적입니다. 이를 위해 우리는 기존 기술을 기반으로 산호 정자의 평가, 취급 및 냉동 보존을 간소화하기 위한 반자동 접근 방식을 만들어 산호 정자에 대한 동결 보존 처리 경로를 최적화하기 시작했습니다. 컴퓨터 지원 정자 분석, 바코드 냉동 및 여러 사용자가 동시에 편집할 수 있도록 일련의 연결된 자동 데이터시트를 결합한 이 프로세스는 현장에서 샘플 처리 및 메타데이터 관리의 효율성을 모두 향상시킵니다. 호주의 산호초 복원 및 적응 프로그램(Reef Restoration and Adaptation Program)과 같은 다방면의 연구 프로그램과의 통합을 통해 냉동 보존은 양식 개체군의 유전자 관리를 촉진하고, 열내성을 강화하기 위한 연구를 지원하며, 산호 종의 멸종을 방지함으로써 대규모 산호초 복원 프로그램에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. 설명된 절차는 전 세계 산호초의 산호 냉동 보존 및 바이오뱅킹 실무자에게 활용될 것이며 연구 실험실에서 대규모 응용 분야로 동결 보존 기술을 전환하기 위한 모델을 제공할 것입니다.

Introduction

전 세계적으로 산호초는 기후 변화로 인한 해양 온난화와 산성화로 인해 산호 종, 개체군 및 유전적 다양성의 손실을 경험하고 있으며, 이러한 중요한 서식지의 생존 가능성을 감소시키고 그들이 지원하는 종에 영향을 미치고 있습니다 ^1,2. 유전학을 장기적으로 확보하는 가장 효과적인 방법은 냉동 보존 및 바이오뱅킹(biobanking)으로, 이는 살아있는 샘플을 액체 질소에서 무기한 냉동 보관할 수 있도록 합니다³. 2012년 산호 정자의 냉동 보존 방법의 개발4은 처음으로 이들 종의 유전학에 대한 바이오뱅킹^{을 가능하게 했으며} 2012년 산호 유전학을 위한 최초의 바이오 저장소의 개발로 이어졌다⁵. 그 이후로, 이 냉동 보존 프로토콜은 더욱^{정교해졌고6} 전 세계적으로 50종 이상의 산호의 유전학을 확보하는 데 사용되었으며, 그 중 30종은 호주의 그레이트 배리어 리프(Great Barrier Reef)에서 왔습니다⁷. 냉동 보존된 산호 정자는 정상적으로 발달하는 건강한 산호를 생성할 수 있으며, 호주⁸와 카리브해9에서 보조 유전자 흐름 실험을 용이하게 하는 데 사용되어^왔다. 유충¹⁰ 및 성인 산호 조직^11,12와 같은 복잡한 조직 유형의 동결 보존을 가능하게 하는 기술이 현재 개발 중이지만, 산호 정자의 동결 보존은 현재 산호 유전학의 일상적인 바이오뱅킹에 사용할 수 있는 가장 확립된 도구입니다.

산호 개체군에 미치는 영향이 증가함에 따라, 몇몇 국가에서는 산호초 복원 및 적응을 지원하거나(예: 호주의 RRAP(Reef Restoration and Adaptation Program)¹³) 남아 있는 멸종 위기에 처한 산호 개체군을 보호하기 위해(예: 미국의 플로리다 산호 구조대(Florida Coral Rescue)¹⁴) 대규모 프로그램을 시작했습니다. 이러한 프로그램의 맥락에서 냉동 보존은 기존의 유전적 다양성을 확보하고 멸종을 방지하는 것 외에도 연구 및 대규모 산호 생산을 지원하는 가능하게 하는 기술로 생각할 수 있습니다. 정자 동결보존은 물리적 또는 시간적으로 분리된 개체군 간의 번식을 더 잘 제어할 수 있게 할 수 있으며, 육종계의 유전적 관리를 통해 내열성 또는 질병 저항성과 같은 바람직한 형질을 선택할 수 있도록 할 수 있다⁸. 현재까지 산호 정자 바이오뱅킹은 생물^{다양성 관리7}를 지원하기 위해 비교적 작은 규모로 수행되어 왔으므로, 이러한 바이오뱅킹이 이러한 대규모 산호초 복원 프로그램 내에서 그 잠재력을 충족하려면 어느 정도의 상향 조정이 필요할 것이다. 산호 번식을 기반으로 한 모든 산호초 복원 노력과 마찬가지로, 바이오뱅킹 노력을 늘리는 데 가장 큰 걸림돌은 산호 생식세포를 이용할 수 있는 기간이 제한되어 있다는 것인데, 이는 대부분의 산호초 형성 종에서 산란이 늦봄과 초여름의 보름달과 일치하기 때문에¹⁵년 동안 며칠 동안만 동결 보존 및 바이오뱅킹을 위해 생식세포를 사용할 수 있음을 의미합니다. 더욱이, 그레이트 배리어 리프(Great Barrier Reef)와 같이 대량 산란이 발생하는 지역에서는 일반적으로 여러 종이 동시에 또는 같은 밤에 서로 몇 시간 이내에 산란합니다¹⁵. 따라서 정자 동결 보존 경로를 개선하여 이러한 짧은 연간 산란 기간 동안 바이오뱅킹 용량을 극대화하는 동시에 샘플 및 관련 메타데이터의 무결성을 보장하기 위해 처리의 규모와 효율성을 높여야 합니다.

산호 정자의 냉동 보존 및 바이오뱅킹에는 산란 중 배우자 수집부터 생체 저장소 및 데이터베이스에 샘플을 접근하는 것까지 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다(그림 1). 이 과정은 난자에서 정자를 분리하는 것(자웅동체 종의 경우) 또는 물기둥에서 정자를 채취하는 것(임질 종의 경우)으로 시작하여 정자의 운동성과 농도를 평가합니다. 그런 다음 정자는 여과된 해수(FSW)에서 동결 보호제(10% v/v 최종 농도, 디메틸 설폭사이드, DMSO)와 결합하고 맞춤형 냉각 장치⁴에서 -20°C/min으로 냉각합니다. 이 프로세스의 초기 반복은 위상차 현미경 및 혈구계 수를 통해 정자의 운동성과 농도를 육안으로 평가하고, 냉동 보존을 위해 샘플을 처리할 때 튜브를 인쇄하고 라벨링하고, 정자 샘플을 냉동 디스크로 수동 피펫팅하고, 특별히 설계된 플로팅 랙¹⁶에서 냉각하는 데 의존했습니다. CASA(Computer-Assisted Sperm Analysis)¹⁷ 의 적용과 3D 프린팅 냉각 장치⁶ 의 개발은 산호 정자 냉동 보존의 효율성과 신뢰성을 향상시켰지만, 정자 샘플 처리 경로는 처음부터 거의 동일하게 유지되었습니다. 이 접근법은 산란일 밤에 적당한 수의 콜로니 및 종의 샘플을 처리하는 데 적합하지만, 대량의 콜로니(예: 한 번에 >10개의 콜로니에서 개별 샘플)의 경우 샘플 수정 가능성의 저하 없이 적시에 (즉, 정자 방출 후 2시간 이내) 샘플 처리를 방해하는 냉동 보존 경로에 병목 현상이 있습니다. 극저온용 대규모 유체 처리 시스템을 사용할 수 있지만(예: Thomas et ^al.18), 일반적으로 대규모 배치 처리(즉, 여러 극저온 랙)를 위해 설계되고 현장에서의 운송 및 사용에 적합하지 않으므로 이 응용 분야에는 비용 효율적이지 않습니다. 따라서 본 연구는 산란일 밤에 효과적으로 냉동 보존할 수 있는 샘플의 수를 최대화하기 위해 처리 경로의 주요 단계에서 휴대 가능하고 저렴한 자동화 장비 및 방법을 도입하여 산호 정자 냉동 보존의 효율성을 향상시키는 것을 목표로 했습니다.

Protocol

본원에 기술된 방법은 자웅동체 및 임질성 산호 종 모두로부터 정자를 처리하고 냉동보존하는데 사용될 수 있다. 두 생식 모드에 대한 정자 냉동 보존을 위한 산호 산란 및 배우자 수집에 대한 일반적인 소개 및 입문서는 Smithsonian’s National Zoo & Conservation Biology Institute 산호 냉동 보존 교육 과정19에서 찾을 수 있습니다. 설명된 방법은 주로 Woppaburra Sea Country의 Keppel Island 그룹과 호주의 Great Barrier Reef에 있는 Bindal Sea Country의 Davies Reef에서 수집된 Acropora millepora 식민지의 배우자를 사용하여 개발되었습니다. 산호와 배우자의 모든 수집 및 사용은 관련 해양 국가의 전통 관리인의 무료 사전 사전 동의하에 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 1. Pre-spawning – 시스템 점검 및 정자 활성화 용액 및 동결 희석제 준비 바코드 스캐너가 충전되어 있고 활성 상태이며 스프레드시트 데이터를 수평 셀 입력으로 입력하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 바코드 리더 사용 설명서를 참조하여 이 설정을 사용자 정의하십시오. CASA를 위한 산호 정자 활성화 농축 스톡 솔루션을 준비합니다.알림: 활성화 용액 준비를 위해 화학 물질을 취급할 때는 일회용 장갑을 착용해야 합니다.37°C로 설정된 튜브 워머를 사용하여 4mL의 멸균 정제 조직 배양수에 BSA 1.5g을 용해시키거나 컵을 쥔 손으로 튜브를 잡고 주기적으로 부드럽게 휘젓습니다(바이알을 흔들지 마십시오). 용액에 들어가면 조직 배양수를 사용하여 최종 부피(5mL)까지 만들고 튜브에 날짜를 표시하고 “H2O의 30% BSA”를 표시합니다. 냉장고(4°C)에서 최대 2주 동안 보관하십시오. 60mL의 여과된 해수(FSW)에 0.2913g의 카페인을 녹여 24mM 카페인 원액(24mL)을 준비합니다. 용액에 넣으면 FSW를 사용하여 최종 부피(25mL)까지 만들고 튜브에 날짜를 라벨링하고 “FSW 내 60mM 카페인”을 표시합니다. 냉장고에 최대 1개월 동안 보관하십시오.참고: FSW에서 카페인의 최대 용해도는 약 71mM입니다. ~109 sperm/mL (FSW에 있는 0.9% BSA + 12 mM 카페인)에 정액 표본을 위한 정액 활성화 작동 해결책을 준비하십시오.10mL 작업 용액의 경우 2.0mL의 60mM 카페인 원액 + 0.3mL의 30% BSA 원액 + 7.7mL의 FSW를 결합합니다. 튜브에 날짜와 “정자 활성화 작업 용액 – 0.9% BSA + 12mM 카페인”이라고 라벨을 붙입니다. 매일 사용할 수 있도록 준비하여 실온(19-30°C)에서 보관하고 사용하지 않은 용액은 하루가 끝나면 폐기하십시오. 동결 보호제 용액(동결 희석제)을 준비합니다. 동결 보호제 DMSO를 취급할 때는 일회용 장갑을 착용해야 합니다.참고: FSW는 샘플 내 초기 정자 농도와 동결 보존된 부분 표본의 원하는 최종 정자 농도에 따라 다양한 동결 보호제 농도로 준비됩니다. 극저온 희석액을 준비할 때 DMSO를 추가하기 전에 FSW가 50mL 튜브에 분주되어 있는지 확인하십시오.산란 전에 산호가 보관되어 있는 탱크 시스템에서 원시 해수를 수집합니다(~35ppt 염도). 0.2μm 비발열성 멤브레인 필터가 장착된 진공 펌프에 부착된 병뚜껑 여과 시스템을 사용하여 원수를 여과합니다. 정자 농도 ≥2 × 109 sperm/mL의 경우 50mL 튜브에 DMSO 10mL + FSW 40mL를 결합하여 FSW에서 20% DMSO를 준비합니다. 정자 농도<2 × 109 sperm/mL의 경우 50mL 튜브에 DMSO 15mL + FSW 35mL를 결합하여 FSW에서 30% DMSO를 준비합니다. 튜브에 날짜와 DMSO 농도(예: 30% DMSO 또는 20% DMSO)로 라벨을 붙입니다. 매일 사용할 수 있도록 준비하여 실온(19-30°C)에서 보관하고 사용하지 않은 용액은 하루가 끝나면 폐기하십시오.알림: DMSO와 FSW의 혼합은 발열 반응을 일으키며 냉동 희석제는 실온으로 냉각할 수 있도록 사용 전에 잘 구성해야 합니다. FSW는 이러한 열 발생을 상쇄하기 위해 극저온 희석액을 준비하기 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다. 열전대 데이터 로거를 준비합니다.각 동결 보존 실행의 대략적인 냉각 속도를 측정하려면 FSW에 10% DMSO가 포함된 저온 두유를 넣고 뚜껑을 통해 삽입된 열전대 프로브를 정자 샘플과 함께 동결 보존 랙의 샘플 슬롯에 놓습니다. 열전대 바이알을 만들려면 바코드가 부착된 극저온 제품의 캡에 작은 구멍을 뚫거나 녹이고 개구부를 통해 K형 또는 T형 열전대를 삽입합니다. 바이알을 채울 때 프로브 팁이 샘플 중앙에 놓이도록 열전대 프로브 팁을 수평으로 밀어 내부 바이알 벽과의 접촉을 방지하기 위해 프로브 팁을 바이알 중앙에 유지합니다. 캡을 밀봉하고 뜨거운 접착제로 열전대 프로브를 제자리에 고정합니다. 일회용 장갑을 끼고 바코드가 찍힌 냉동 보관 공간을 냉동 보존할 정자 샘플의 부피와 동일한 FSW의 10% DMSO로 채웁니다. FSW에서 새로운 10% DMSO를 준비하고 매일 열전대 바이알을 리필합니다. 2. 정자 준비 및 평가 자웅동체 종(예: Acropora 종)의 경우 3mL 전사 피펫을 사용하여 물 표면에서 배우자 다발을 채취하고 5mL의 해수(총 부피 10mL)에 대한 5mL의 생식세포 다발의 비율로 라벨이 부착된 50mL 튜브에 넣습니다. 임질종의 경우 3mL 이송 피펫을 사용하여 용종 입 가까이에서 정자를 채취하고 검체를 라벨이 부착된 50mL 튜브에 넣은 다음 바로 2.8단계로 진행합니다.참고: 일회용 장갑은 배우자 샘플의 수집 및 취급에 필요하지 않지만 원하는 경우 착용할 수 있습니다. 손을 깨끗한 물로 철저히 씻거나 교차 오염을 피하기 위해 각 배우자 검체 사이에 장갑을 교체해야 합니다. 자웅동체 종의 경우, 정자 다발이 분리될 때까지 샘플을 손으로 부드럽게 휘저어 정자-난자 다발을 교반합니다.참고: 일부 Montipora 종은 난자에 독소가 있으므로 정자를 손상시키지 않도록 최소한의 교반으로 천천히 떨어지도록 해야 합니다. 난자가 표면으로 떠오르고 정자가 가라앉을 수 있도록 샘플을 튜브 랙에 2분 동안 그대로 두십시오(난자는 표면에 분홍색/갈색 층을 형성하고 개별 난자가 보입니다. 그림 1i 참조). 정자를 분리하고 오염된 난자를 제거하려면 깨끗한 3mL 전사 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 정자를 부드럽게 흡입합니다. 정자 샘플을 새로운 멸균 50mL 원심분리기 튜브 위에 있는 100μm 세포 여과기로 옮깁니다. 샘플은 필터를 통해 쉽게 흐러야 합니다. 필터를 두드려 시료 흐름을 유도하고, 필요한 경우 깨끗한 이송 피펫을 사용하여 필터 밑면의 잔류 시료를 채취할 수 있습니다. 필터를 제거한 다음 공기 교환을 위해 튜브를 느슨하게 닫습니다. 필터링된 정자 샘플에 콜로니 ID로 레이블을 지정하고 샘플을 정자 평가 워크스테이션으로 이동합니다. 산호 바이오뱅킹 자동 데이터시트 파일(보충 파일 1)을 엽니다. 정자 평가 탭에서 산호 군락 메타데이터(A-H 열)를 입력합니다. CASA 평가를 위해 정자를 준비합니다.정자 샘플을 잘 섞고 빈 1.8mL 미세 원심분리기 튜브에서 10μL 분취액을 제거합니다. 즉시 0.390mL의 정자 활성화 작업 용액을 10-20초에 걸쳐 적가하여 정자를 용액에 부드럽게 혼합합니다. 이는 1:39(정자: 용액, v/v)(또는 희석 계수 40)의 희석 비율을 제공하며, 이는 원시 정자 농도가 ~2 × 109 정자/mL인 경우 CASA 평가에 적합한 농도(~50 × 106/mL)를 제공합니다. 튜브를 5번 뒤집고 열기 전에 튜브 뚜껑을 튕겨 용액이 튜브 바닥에 가라앉습니다.참고: CASA의 정자 농도는 정확한 정자 추적을 위해 8-50 × 106/mL 범위여야 한다17. 추가 정액 활성화 작업 용액을 원시 정액 분취액에 추가하여 필요한 경우 농도를 줄일 수 있습니다. 희석률을 다시 계산하고 이 값을 스프레드시트에 입력합니다. 많은 시료를 동시에 처리해야 하는 경우, 1.8mL 미세원심분리기 튜브에 0.390mL의 정자 활성화 작업 용액과 10μL의 정자 시료 분취액을 직접 첨가한 다음 튜브를 10× 뒤집고 튜브 뚜껑을 튕겨 잘 혼합할 수 있습니다. Zuchowicz et al.17에 설명된 대로 컴퓨터 보조 정자 분석(CASA)을 사용하여 4μL의 활성화된 정자 현탁액을 Makler 계수 챔버(20)에 배치하거나 Hagedorn et al.4에 설명된 위상차 현미경 하에서 육안 평가 및 혈구계 수를 사용하여 활성화된 샘플의 운동성 및 농도를 평가합니다.참고: Makler 챔버와 커버슬립은 70% 에탄올로 잘 세척한 다음 증류수로 세척하고 샘플 사이에 보풀이 없는 티슈 와이프로 닦아야 합니다. CASA 평가에 사용되는 정자 희석 인자를 입력하고 정자 농도(백만/mL), 총 운동성(%) 및 점진적 운동성(%)에 대한 CASA 출력을 자동 데이터시트에 입력합니다.참고: VAP(Average Path Velocity), VSL(Straight-Line Velocity) 및 VCL(Curvilinear Velocity)을 포함한 추가 CASA 메트릭은 선택적으로 자동 데이터시트에 포함하거나 나중에 저장된 CASA 파일에서 검색할 수 있습니다. 여과된 정자 샘플 튜브에 정자 농도를 기록하고 번들 분해 및 처리와 동일한 순서로 샘플을 냉동 보존 워크스테이션으로 옮깁니다. 3. 정자 희석 및 동결 보호제 평형 냉동 보존 워크스테이션에서 정자 평가 워크스테이션에서 사용 중인 것과 동일한 산호 바이오뱅킹 자동 데이터시트 파일을 열고 냉동 보존 탭을 선택합니다. 정자 샘플 튜브 라벨을 확인하고 Colony ID(C열)를 확인하여 해당 항목을 식별합니다. 워크스테이션 간에 동일한 자동 데이터시트 파일에 동시에 액세스하지 않는 경우 자동 데이터시트의 콜로니 ID(C열) 및 정자 농도(F열) 에 데이터를 수동으로 입력합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 샘플을 피펫으로 끌어들여 동일한 튜브로 다시 배출하여 정자 샘플 부피를 측정합니다. E 열에 값을 입력합니다. 자동 계산된 I열 에서 필요한 동결 보호제 농도를 확인하고 H 열 에서 추가할 극저온 보호제의 부피를 확인합니다(표 1). 10분 동안 타이머를 시작하고 혈청학적 피펫을 사용하여 즉시 샘플을 지속적으로 부드럽게 혼합하면서 극저온 희석제를 적하 방식으로 추가하기 시작하여 DMSO 처리를 위해 일회용 장갑을 착용하도록 합니다. P 열에 극저온 첨가 시간을 기록합니다. 정자 농도 극저온 희석제 희석 비율(정자:cryodiluent) 정자 샘플의 최종 DMSO 농도(%) < 2 × 109/mL FSW에서 30% DMSO 2:1 10% ≥ 2 × 109/mL FSW에서 20% DMSO 1:1 10% 표 1: 산호 정자의 동결 보존을 위한 동결 희석제 농도 및 희석 비율, 동결 보존할 샘플의 총 정자 농도 평가를 기반으로 합니다. 4. 정자 동결 보존 K열을 읽고 얼마나 많은 cryovials를 채울 것인지 결정하십시오. 이것은 정자의 총 부피와 바이알당 원하는 부피(대부분의 경우 1mL)에서 자동 계산됩니다. 10분의 잠복기 동안 4.2-4.6단계를 진행합니다. 멸균 바코드가 부착된 극저온 바이러스의 뚜껑을 열고 깨끗하고 멸균된 표면에 캡을 놓습니다. 선택 사항: 영구 마커를 사용하여 각 cryovial에 run #을 작성합니다. 이는 바이오뱅크에 가입하기 위한 빠른 샘플 식별에 도움이 될 수 있습니다. 혈청학적 피펫과 원하는 시료 부피(1mL)로 설정된 분취 피펫을 사용하여 시료를 뚜껑이 없는 바코드 냉동 및 리캡 바이알에 분취합니다. 열전대 바이알 1개와 전체 샘플 바이알 전체를 실온의 빈 cryo rack에 넣습니다. 모든 바이알에서 바코드가 부착된 표면이 바깥쪽을 향하고 있는지 확인합니다. 필요한 경우 FSW에 10% DMSO가 포함된 추가 더미 극저온을 극저온 랙의 빈 공간에 배치하여 모든 공간이 채워지도록 합니다. 자동 데이터시트(U열)에 실행 번호를 입력하고 크라이오 랙 일련 번호(QR 코드)를 V열로 스캔합니다. Z 열의 올바른 셀에 커서를 놓고 열전대 바이알을 스캔한 다음 랙에 로드된 모든 극저온 튜브(AA 열 이후)를 스캔합니다. 샘플이 바이알의 나사산에 들어가지 않도록 랙을 옆으로 기울이지 마십시오. 스캔하는 동안 데이터가 올바른 셀에 입력되고 있는지, 모든 극저온 디스크가 한 번 스캔되었는지 교차 확인하십시오. 동결 보호제 평형 기간의 나머지 기간 동안 적재 및 스캔된 랙을 따로 보관하고 동결 보존을 위해 냉각 용기를 준비합니다. cryo rack 냉각 용기에 액체 질소를 약 -20°C/min에서 냉각하는 데 필요한 미리 결정된 적절한 수준으로 채웁니다.알림: 질소는 질식의 위험이 있으므로 환기가 잘 되는 곳에서만 사용해야 합니다. 액체 질소를 취급할 때는 발가락이 막힌 신발, 보안경/안면 보호대, 냉동 장갑을 착용해야 합니다. 액체 질소 취급 및 사용에 대한 구체적인 정보는 기관 지침을 참조하십시오. 10분의 동결 보호제 평형 기간이 끝나면 열전대 프로브를 데이터 로거에 연결하고 녹음을 시작한 다음 전체 극저온 랙을 냉각 용기에 부드럽게 넣고 뚜껑을 적용합니다. Q 열에 시작 시간을 기록합니다. 열전대 바이알이 데이터 로거에서 -80 °C 이하로 판독되면 cryo rack insert를 폴리스티렌 상자와 같은 별도의 용기에 있는 액체 질소 수조로 옮겨 액체 질소로 샘플을 담금질합니다. 랙에서 극저온을 제거하고 생물 저장소로 운송하기 위해 건조 선적업체로 옮깁니다.

Representative Results

이 프로토콜에 설명된 단계는 Hagedorn et al.4 이 설명한 산호 정자 동결 보존을 위한 원래 방법과 Zuchowicz et al.6의 후속 개선을 기반으로 하며, 동결 보존 및 바이오뱅킹을 위한 정자 처리의 효율성을 높이기 위한 주요 개선 사항을 제공합니다. 바코드가 부착된 극저온 피펫과 부분 표본 자동 피펫터를 사용하면 극저온 비페알을 인쇄하고 수작업으로 라벨링할 필요가 없어 정자 포장 절차가 간소화되고 많은 수의 샘플을 수동으로 피펫팅하는 부담을 줄일 수 있습니다. 중요한 것은 이러한 개선으로 냉동 보존을 위한 시료 준비에 필요한 시간이 약 8-10분에서 5분 미만으로 단축된다는 것입니다. CASA의 사용과 함께 이러한 개선은 산호 정자의 효율적인 바이오뱅킹에 필요한 인력 수를 기존 방법의 4명에서 6명으로 줄였으며 현재 프로토콜을 사용하는 사람은 2명으로 줄었습니다. 또한 바코드된 극저온 디스크를 사용한다는 것은 각 튜브에 고유 식별자가 있음을 의미하므로 배치 인쇄 라벨을 사용하는 이전 방법보다 더 높은 해상도로 데이터베이스 내에서 각 튜브를 추적할 수 있습니다. 2022년 호주 그레이트 배리어 리프 산란 시즌 동안 두 번의 산란 이벤트에 대한 프로토콜의 현장 테스트는 두 명의 작업자(CASA의 경우 1명, 동결 보존의 경우 1명)가 5종의 57개 군체에서 389개의 샘플을 냉동 보존 및 바이오뱅킹했으며, 필요에 따라 한 명의 추가 인원이 다발 분해 및 정자 분리를 지원했습니다. 2022년 11월 호주 퀸즐랜드의 코노미(North Keppel Island)에서 열린 산란 행사에서 Acropora millepora 의 24개 군체에서 채취한 150개의 샘플이 두 명의 작업자에 의해 2시간 동안 냉동 보존되었습니다. 이렇게 많은 수의 산호 군락에서 채취한 이 대량의 시료를 효율적으로 처리하고 냉동 보존할 수 있었던 것은 주로 시료 전처리 시간의 효율성과 워크스테이션 간의 메타데이터 전송이 간소화되었기 때문에 가능했습니다. 2023년 12월 산란 중 워크플로우에 대한 추가 테스트를 통해 산호 정자의 경우 Makler 계수 챔버가 CASA 시스템과 함께 일반적으로 사용되는 상용 고정 커버슬립 일회용 챔버 슬라이드에 비해 더 정확한 운동성 및 농도 데이터를 제공하는 것으로 확인되었습니다. Makler 계수 챔버는 4 μL 샘플 부피와 산호 정자에 사용되는 표준 CASA 설정17 을 가진 알려진 농도의 상업적으로 이용 가능한 라텍스 마이크로비즈를 사용하여 CASA에 대해 검증되었습니다. 이러한 분석은 제조업체가 제공한 예상 농도 범위(46.0 ± 700만/mL) 내에 속하는 낮은 변동성(44.5 ± 700만/mL)으로 일관된 수치를 보여주었습니다(그림 2). Makler 계수 챔버와 고정 커버슬립 챔버 슬라이드를 사용하여 수집된 Acropora millepora 에 대한 CASA 데이터를 비교한 결과, 두 챔버 유형 간의 정자 농도 수에서 유의한 차이가 발견되었습니다(P = 0.002; 그림 2), 고정 커버슬립 챔버 슬라이드는 Makler 계수 챔버를 사용하여 측정된 농도의 절반 미만을 등록합니다. 이러한 경향은 두 개의 다른 산호 종의 정자 샘플에서도 관찰되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한 2023년 12월 동안의 테스트에서는 20% DMSO로 1:1 희석 또는 30% DMSO로 1:2 희석(정자: 극저온 희석)을 사용하여 냉동 보존된 샘플에서 총정자, 운동성 정자 또는 점진적 운동성 정자의 해동 후 농도에서 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다(그림 3). 그림 1: 냉동 보존을 위한 산호 정자의 반자동 처리에 사용되는 워크플로우 및 현장에서 사용되는 모바일 장비의 예. (A) 산호 배우자 다발은 FSW 5mL 이상인 5mL 다발의 비율로 수집되고 난자와 정자를 분리하기 위해 분해됩니다(i). 콜로니 메타데이터는 자동 데이터시트(ii)에 입력되고 분리된 정자 샘플은 컴퓨터 보조 정자 분석(CASA)(iii)을 사용하여 평가됩니다. FSW(iv)에서 20% 또는 30% DMSO의 첨가를 계산하기 위해 정자 품질 매개변수가 자동 데이터시트에 추가되고, 희석된 샘플은 바코드가 부착된 극저온(v)에 분주됩니다. 극저온 분은 극저온 랙에 로드되고 자동 데이터시트(vi)로 스캔된 후 -20°C/min에서 -80°C(vii)의 속도로 냉각됩니다. 그런 다음 샘플을 액체 질소로 담금질하고 Taronga CryoDiversity Bank(viii)로 운송하기 위해 건조 선적업체로 이송됩니다. (B) 코노미 환경 교육 센터(Konomie Environmental Education Centre)의 교실에서 원격 현장 현장에 설치된 CASA(왼쪽) 및 냉동 보존 스테이션의 예. (C) 호주 해양 과학 연구소(Australian Institute of Marine Science)에서 여러 크라이오 랙을 운영하기 위해 설치된 실험실 기반 고용량 냉동 보존 스테이션의 예: National Sea Simulator. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 산호 정자 농도 측정을 위한 두 가지 다른 챔버 슬라이드 옵션 비교. (A) Makler 계수 챔버와 상업적으로 이용 가능한 고정 커버슬립 챔버 슬라이드를 사용한 Acropora millepora (n = 3명)의 총 정자 농도 측정 비교. 열은 평균 ± SEM을 표시합니다. 별표는 유의한 차이(P = 0.002)를 나타냅니다. (B) 산호 정자에 대한 알려진 농도 및 표준 CASA 설정에서 상업적으로 이용 가능한 라텍스 마이크로비즈를 사용한 Makler 계수 챔버의 검증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 동결 보존된 샘플에서 총정자, 운동성 정자 또는 점진적 운동성 정자의 해동 후 농도. 냉동 보존을 위한 최종 10% DMSO 농도를 달성하기 위해 FSW에서 20% 또는 30% DMSO를 사용하여 총, 운동성 및 점진적 운동성 정자 농도의 해동 후 비교. n = 3명의 개체에서 채취한 샘플을 각각 2개의 분취액으로 분할하였으며, 1개의 분취액은 20% DMSO를 1:1로 동결 보존하였고, 두 번째 분취액은 30% DMSO의 1:2 첨가(정자: 동결 희석)로 냉동 보존을 위해 FSW를 사용하여 <2 × 109/mL로 희석하였다. 열에는 평균± SEM이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 1: 산호 바이오뱅킹 자동 데이터시트 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜에 설명된 반자동 처리 경로를 통해 산호 정자의 효율적인 처리 및 냉동 보존을 통해 멸종 위기에 처한 종으로부터 유전학을 보호하고 산호초 복원 및 적응 노력을 지원할 수 있습니다. 이 프로토콜의 개발 동기는 정자 동결 보존을 위한 고처리량 처리 시스템이 일반적으로 0.25mL 또는 0.5mL 프렌치 빨대의 샘플 포장을 기반으로 하기 때문에 산호 정자 동결 보존 및 동결 사용의 처리량 요구 사항에 적합한 기존 시스템이 없었기 때문입니다^21,22. 이에 비해 극저온은 일반적으로 저처리량 처리(예^{: 연구를 위한} 실험실 샘플의 동결 ^보존)를 위해 소규모로 사용되거나 고가의 휴대용 장비(예: 산업용 세포 배양 처리)를 사용하는 벌크 샘플용 고처리량 처리 시스템(예: 산업용 세포 배양 처리)에 사용됩니다^18,25). 또한 극저온 캡의 제거 및 교체를 간소화하기 위해 자동 디캡 시스템을 사용할 수 있는 가능성을 조사했지만, 시스템은 개별 극저온 또는 전체 극저온 랙에만 사용할 수 있었기 때문에 비용 효율적인 솔루션을 제공하지 못했습니다. 현재 산호의 유전적 다양성을 확보하기 위해 Hagedorn et ^al.4이 고안한 냉동 보존 프로토콜을 사용하는 여러 그룹이 전 세계적으로 있으며, 이 작업이 전 세계의 더 많은 산호초로 계속 확장되는 것이 중요합니다. 따라서 현재 프로토콜 개발의 주요 고려 사항은 이러한 다른 그룹이 쉽게 구현할 수 있고 산호 정자 동결 보존을 시작하려는 새로운 그룹에게 비용이 많이 들지 않는 비용 효율적이고 접근 가능한 기술을 활용해야 할 필요성이었습니다.

설명된 프로토콜의 핵심 구성 요소는 Microsoft Excel의 연결된 스프레드시트를 통해 샘플 메타데이터를 개선하는 것입니다. 데이터 입력은 일반적으로 간단하지만, 데이터를 편집하는 빠른 기능(예: Ctrl + C, Ctrl + V)은 잠재적으로 다른 사용자의 동시 입력에 영향을 미치고 스프레드시트 간의 데이터 연결에 문제를 일으킬 수 있으므로 자동 데이터시트의 정보 편집은 정보를 삭제하고 다시 입력해야만 수행해야 합니다. 중요한 메타데이터 구성 요소는 공여 콜로니에 연결되고 처리 경로의 모든 단계에서 샘플에 첨부되는 고유 식별자(즉, 콜로니 ID)입니다. 번들 채취 시 시료 튜브에 콜로니 ID를 명확하게 라벨링하고, 이 정보를 전처리 중(예: 난자와 정자를 분리하기 위한 여과 중 또는 극저온 희석제 첨가를 위해) 샘플이 옮겨지는 새로운 튜브에 정확하게 기록하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하면 CASA 작업자에서 냉동 보존 워크스테이션으로 시료 품질 정보를 자동으로 전송할 수 있지만 인터넷 또는 Wi-Fi 범위가 좋지 않을 때 문제가 발생할 수 있습니다. 데이터 전송 지연이 발생하면 두 워크스테이션을 오프라인으로 작업하고 나중에 조정할 수 있는 별도의 자동 데이터시트를 유지 관리하는 것이 좋습니다. 동결 보존 작업자가 필요로 하는 주요 정보는 콜로니 ID와 시료 농도이므로, 컴퓨터 간의 메타데이터 업로드 또는 다운로드가 지연되는 경우 이 정보가 동결 보존 준비에 도움이 될 수 있도록 CASA 운영자가 시료 튜브에 시료 농도를 백업으로 기록하는 것이 좋습니다.

이 프로토콜에 사용되는 바코드 스캐너 및 바코드 극저온 보호의 선택은 예산 및 제품 가용성에 맞게 다양할 수 있습니다. 그러나 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 핵심 요소가 있습니다. 바코드 스캐너는 사용자 정의 설정, 특히 데이터 입력 사양 및 데이터 입력 방향을 변경할 수 있는 기능이 있어야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 자동 데이터시트는 수평 입력을 사용하지만 경우에 따라(예: 바이오뱅크 가입 또는 기타 실험실 용도) 수직 입력이 필요할 수 있으므로 이 기능을 사용자 정의할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜은 1D 및 2D 바코드 모두와 함께 사용할 수 있지만, 선택한 극저온 보유량에는 사람이 읽을 수 있는 구성 요소(예: 1D 바코드에는 일반적으로 고유 번호가 포함됨)가 있어 동결 보존 중 시료 입구를 교차 확인할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 샘플 입력 외에도 바코드 스캐너를 사용하여 산란 전에 샘플에서 반복되는 정보(예: 종 이름, 날짜 및 암초 위치)에 대한 QR 코드를 생성하고 인쇄하여 일부 메타데이터 필드의 입력을 자동화할 수 있습니다. 그런 다음 이 정보를 바코드 스캐너로 스캔하여 자동 데이터시트에 빠르고 쉽게 입력할 수 있습니다. 또한 각 극저온 랙 및 열전대 프로브에 일련 번호 바코드를 부착하여 각 동결 보존 실행을 데이터베이스 내의 특정 장비 세트와 연결할 수도 있으며, 이는 품질 관리에 유용하고 수리 또는 교체가 필요한 구성 요소를 식별하는 데 유용합니다.

처리의 제한 요인은 종종 다발이 분해될 때까지 기다리는 데 소요되는 시간과 CASA 및 냉동 보존 전에 난자에서 정자를 여과하고 분리하는 데 필요한 시간입니다. 가능한 경우 번들이 분해되는 순서대로 샘플을 처리하는 것이 좋습니다. 그러나 시료 처리 주문의 전략적 관리를 통해 효율성을 더욱 높일 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 부피가 적거나(즉, 콜로니당 정액이 3mL 미만) 정자 농도가 낮아 크라이오딜루언으로 2:1 희석이 필요한 경우(즉, 2 × 10⁹/mL 미만), 동일한 크라이오 랙에서 함께 실행할 수 있도록 동시에 두 개의 콜로니 샘플에 크라이오딜루언을 추가하는 것이 좋습니다(총 # 사용 가능한 슬롯 = 11). 빈 공간을 채우는 더미로 따로 실행하는 것보다는. 또한 모든 공정이 10분 극저온 평형 시간 내에 완료될 수 있도록 주의를 기울인다면 여러 크라이오 랙을 동시에 가동할 수 있으며(시료 용량>이 6mL 용량인 경우) 시료 처리량을 더욱 증가시킬 수 있습니다. 그러나 여러 크라이오 랙을 실행하거나 단일 크라이오 랙에서 여러 콜로니를 결합할 때, 특히 샘플이 CASA 평가와 다른 순서로 냉동 보존되는 경우 자동 데이터시트의 올바른 샘플에 동결 보존 메타데이터가 할당되도록 주의를 기울여야 합니다.

반자동 워크플로우의 개발 외에도, 본 프로토콜 설명은 정자 분석 및 동결 보존 결과를 개선하는 것을 목표로 하는 정자 농도와 관련된 두 가지 방법론적 비교를 제공합니다. 일반적으로 해수 5mL(총 부피 10mL) 이상의 배우자 다발 5mL를 채취하면 정자 농도가 2 × 10⁹ cells/mL 이상이지만 종 차이 또는 채취 중 다발이 깨져 정자 농도가 낮아질 수 있는 경우가 있습니다. 더 높은 농도의 DMSO 동결 희석제(30% v/v)를 사용하면 정자가 희석되는 양이 줄어들어 동결 내 정자 농도의 배치 간 변동을 최소화할 수 있습니다. 중요한 것은 최종 DMSO 농도를 달성하기 위해 30% DMSO를 사용해도 그림 3의 대표 데이터에서 볼 수 있듯이 해동 후 농도 또는 운동성 매개변수에 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 두 번째 방법론적 비교는 CASA에 일반적으로 사용되는 일회용 고정형 커버슬립 챔버 슬라이드에 대한 대안을 제공합니다. 산호 정자 분석을 위해 상업적으로 이용 가능한 슬라이드를 사용할 때의 주요 과제는 정자가 슬라이드 코팅에 달라붙기 때문에 운동성 평가의 정확도에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 활성화 솔루션을 사용하면 모든 샘플은 아니지만 많은 샘플에서 이 문제를 극복할 수 있으므로 신뢰성과 일관성을 보장하기 위해 일반 슬라이드를 사용하여 운동성에 대한 별도의 CASA 분석을 수행하는 것이 좋습니다. Makler 계수 챔버를 사용하면 농도와 운동성을 별도로 분석해야 할 필요성을 극복하고 농도 측정의 정확도를 향상시킬 수 있으므로(그림 2) 전류 프로토콜과 함께 사용하는 것이 좋습니다. 농도 측정의 이러한 불일치를 감안할 때, 이전에 보고된 바 있는²⁰개의 발견을 감안할 때, 항상 정자 품질 데이터와 함께 데이터베이스에 슬라이드 세부 정보를 기록하는 것이 중요하며, 가능한 한 배치 간 변동을 최소화하고 정자의 신뢰할 수 있는 계산을 보장하는 데 사용되는 챔버 슬라이드 유형(수정을 위한 난자 비율)에서 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.

본 문서에 설명된 반자동 공정은 멸종 위기에 처한 산호 종의 정자를 냉동 보존하고 바이오뱅킹을 하는 동시에 샘플의 생물 안전성과 품질을 유지하기 위한 표준화되고 효율적인 경로를 제공합니다. 설명된 프로토콜은 멸종을 예방하고 현재와 미래의 산호초 복원 노력에 사용할 수 있는 자원을 최대화하기 위해 필수적인 냉동 보존을 사용하여 기존 산호 다양성을 보호하기 위해 노력하는 전 세계 프로그램에서 구현하기 쉽고 상대적으로 저렴합니다.

Materials

Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller – Aliquotting pipette	Vistalab	2100-1005	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk)	Thermo Scientific	Nunc 170355	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk)	Thermo Scientific	Nunc  170356	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor	Gilson	F144054M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor	Gilson	F144055M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor	Gilson	F144056M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor	Gilson	F144058M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor	Gilson	F144059M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump	Millipore	WP6122050	Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system	Thermo Scientific	DS0320-5045	Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters	Merck Millipore	GSWP04700	Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water	N/A	–	Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750	Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction	Sigma-Aldrich	A9647	Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes – racked	Thermo Scientific	339651	Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked	Thermo Scientific	339653	For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes	Thermo Scientific	Samco 202PK	To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets	Fisher Scientific	22363549	To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks	Interpath	511029	Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube	Eppendorf	30120086	Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18×18 mm	Brand	4700 45	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75×25 mm	Corning	2947	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer	Hausser Scientific	1492	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B)	IMV Technologies	025107	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA)	IVFStore	SM-373	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads	Hamilton-Thorne	710111	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop	Hamilton Thorne	Ceros II	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses	Generic	–	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat	Long sleeve, full length	–	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair)	Tempshield	Mid-Arm	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps	Generic	–	For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible)	Zebra	DS2278	For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable	Eppendorf	30079434	Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack	Simport	T315	Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks	Custom	–	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid	Custom	–	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container	Isosteel	VA-9683	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers	Generic	–	For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L	BelArt	M16807-9104	For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel	Omega	HH520	Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K	Omega	5SC-TT-K-30-36	Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen	Staedtler Lumocolor	318	Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper – charged	Taylor Wharton	CXR100, or CX500	For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage