Summary

قياس الاستعمار البكتيري على جذور أرابيدوبسيس ثاليانا في حالة الزراعة المائية

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

يعد استعمار البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات (PGPR) في الغلاف الجذري أمرا ضروريا لتأثيره المعزز للنمو. من الضروري توحيد طريقة الكشف عن استعمار الجذور البكتيرية. هنا ، نصف طريقة قابلة للتكرار لقياس الاستعمار البكتيري على سطح الجذر.

Abstract

يعد قياس الاستعمار البكتيري على جذر Arabidopsis thaliana أحد أكثر التجارب شيوعا في دراسات التفاعل بين النبات والميكروب. طريقة موحدة لقياس الاستعمار البكتيري في الجذور ضرورية لتحسين التكاثر. قمنا أولا بزراعة A.thaliana المعقمة في ظروف الزراعة المائية ثم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدرهOD 600 من 0.01. في 2 أيام بعد التلقيح ، تم حصاد أنسجة الجذر وغسلها ثلاث مرات في الماء المعقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. ثم تم وزن الجذور ، وتم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر بواسطة دوامة. تم تخفيف تعليق الخلية في تدرج مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، متبوعا بالطلاء على وسط أجار Luria-Bertani (LB). تم تحضين الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، وبعد ذلك ، تم عد المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها للإشارة إلى الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور. تستخدم هذه الطريقة للكشف عن الاستعمار البكتيري في الجذور في ظروف التفاعل الأحادي ، مع قابلية استنساخ جيدة.

Introduction

هناك طرق كمية ونوعية للكشف عن استعمار الجذور بواسطة سلالة بكتيرية واحدة. بالنسبة للطريقة النوعية ، يجب استخدام سلالة تعبر بشكل أساسي عن التألق ، ويجب فحص توزيع التألق وشدته تحت المجهر الفلوري أو أدوات البؤر بالليزر 1,2. يمكن أن تعكس هذه الاستراتيجيات الاستعمار البكتيري في الموقع3 ، لكنها ليست دقيقة مثل طرق عد الألواح التقليدية في القياس الكمي. إلى جانب ذلك ، نظرا لمحدودية عرض مناطق الجذر الجزئية فقط تحت المجهر ، يمكن أن تتأثر أحيانا بالتحيز الذاتي.

هنا ، نصف طريقة كمية ، والتي تتضمن جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة وعد وحدات CFU البكتيرية على طبق. تعتمد هذه الطريقة على التخفيف والطلاء الذي يمكن من خلاله حساب السلالات المستعمرة التي تم تجريدها من جذور النباتات ، ويمكن حساب إجمالي عدد البكتيريا المستعمرة على الجذر 4,5.

أولا ، تم استزراع A. thaliana في ظروف الزراعة المائية ، ثم تم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدره 0.01 OD600. تم حصاد الأنسجة الجذرية المصابة 2 أيام بعد التلقيح وغسلها في ماء معقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. علاوة على ذلك ، تم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر ، وتخفيفها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ومطلي على وسط أجار Luria-Bertani (LB). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، تم حساب المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها لتحديد الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور.

هذه الطريقة قابلة للتطبيق بدرجة كبيرة ، ولديها قابلية تكرار جيدة ، وهي أكثر ملاءمة لتحديد الاستعمار البكتيري الجذري بدقة.

Protocol

1. الزراعة المائية المعقمة A. thaliana تحضير شتلات A. thaliana .تحضير وسط شتلات A. thaliana المستزرع والذي يتكون من وسط 1/2 MS (Murashige و Skoog) مع 2٪ (وزن / حجم) سكروز و 0.9٪ (وزن / مجلد) أجار. صب وسط التعقيم المحضر في أطباق بتري مربعة معقمة (13 سم × 13 سم) قبل التصلب. تجنب تجف…

Representative Results

لاختبار دقة قدرة استعمار البكتيريا المكتشفة بهذه الطريقة في جذمور A. thaliana ، قمنا بتلقيح Bacillus velezensis SQR9 WT ومتحولة مشتقة Δ8mcp في A. thaliana rhizzosphere بشكل منفصل. Δ8mcp هو متحولة تفتقر إلى جميع جينات تشفير المستقبلات الكيميائية ، ولها استعمار منخفض بشكل ملحوظ6. قمنا ?…

Discussion

لتحقيق قابلية استنساخ جيدة ، هناك أربع خطوات حاسمة لعملية الكشف عن الاستعمار لهذا البروتوكول. أولا ، من الضروري التأكد من أن عدد خلايا البكتيريا الملقحة هو نفسه تماما في كل تجربة. ثانيا ، من الضروري أيضا التحكم في كثافة تنظيف البكتيريا غير المستعمرة بالماء المعقم. ثالثا ، يجب أن تكون كل عم?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32370135) ، وبرنامج الابتكار التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية (CAAS-CSAL-202302) ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا لكلية جيانغسو المهنية للزراعة والغابات (2021kj29).

Materials

6-well plate Corning 3516
Filter cell stainer Solarbio F8200-40µm
Microplate reader  Tecan Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium Hopebio HB8469-5
NaClO Alfa L14709
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Square petri dish Ruiai Zhengte PYM-130
Vortex Genie2 Scientific Industries G560E

References

  1. Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
  2. Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
  3. Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
  4. Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
  5. Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
  6. Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
  7. Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
  8. Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
  9. Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
  10. Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
  11. Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
  12. Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
  13. Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
  14. Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
  15. Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).

Play Video

Cite This Article
Shu, X., Li, H., Wang, J., Wang, S., Liu, Y., Zhang, R. Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition. J. Vis. Exp. (205), e66241, doi:10.3791/66241 (2024).

View Video