Måling av bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana røtter i hydroponisk tilstand
Summary
Kolonisering av plantevekstfremmende rhizobakterier (PGPR) i rhizosfæren er avgjørende for den vekstfremmende effekten. Det er nødvendig å standardisere metoden for deteksjon av bakteriell rhizosfæren kolonisering. Her beskriver vi en reproduserbar metode for å kvantifisere bakteriekolonisering på rotoverflaten.
Abstract
Måling av bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana rot er et av de hyppigste forsøkene i plantemikrobe interaksjonsstudier. En standardisert metode for måling av bakteriell kolonisering i rhizosfæren er nødvendig for å forbedre reproduserbarheten. Vi dyrket først steril A.thaliana i hydroponiske forhold og inokulerte deretter bakteriecellene i rhizosfæren ved en endelig konsentrasjon på OD600 på 0,01. På 2 dager etter inokulering ble rotvevet høstet og vasket tre ganger i sterilt vann for å fjerne de ukoloniserte bakteriecellene. Røttene ble deretter veid, og bakteriecellene kolonisert på roten ble samlet inn av virvel. Cellesuspensjonen ble fortynnet i en gradient med en fosfatbufret saltvannsbuffer (PBS), etterfulgt av plettering på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 10 timer, og deretter ble de enkelte koloniene på LB-plater talt og normalisert for å indikere bakteriecellene kolonisert på røtter. Denne metoden brukes til å oppdage bakteriell kolonisering i rhizosfæren i mono-interaksjonsbetingelser, med god reproduserbarhet.
Introduction
Det finnes kvantitative og kvalitative metoder for å oppdage rhizosfærekolonisering av en enkelt bakteriestamme. For den kvalitative metoden bør en stamme som konstitutivt uttrykker fluorescens brukes, og fluorescensfordelingen og intensiteten bør undersøkes under fluorescensmikroskopi eller laserkonfokalinstrumenter 1,2. Disse strategiene kan godt reflektere bakteriell kolonisering in situ3, men de er ikke like nøyaktige som tradisjonelle platetellingsmetoder i kvantifisering. Dessuten, på grunn av begrensningen av bare å vise delvise rotsoner under mikroskopet, kan det noen ganger påvirkes av subjektiv skjevhet.
Her beskriver vi en kvantitativ metode, som inkluderer å samle de koloniserte bakteriecellene og telle bakterielle CFUer på en tallerken. Denne metoden er basert på fortynning og plating der de koloniserte stammene som ble fjernet fra planterøtter kan telles, og det totale koloniserte bakterietallet på roten kan beregnes 4,5.
Først ble A. thaliana dyrket under hydroponiske forhold, og deretter ble bakterieceller inokulert i rhizosfæren ved en endelig konsentrasjon på 0, 01 OD600. Det infiserte rotvevet ble høstet 2 dager etter inokulering og vasket i sterilt vann for å fjerne de ukoloniserte bakteriecellene. Videre ble bakterieceller kolonisert på roten samlet, fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS) buffer og belagt på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Etter inkubering ved 37 °C i 10 timer ble enkeltkolonier på LB-plater talt og normalisert for å bestemme bakteriecellene kolonisert på røttene.
Denne metoden er svært anvendelig, har god repeterbarhet, og er mer egnet for nøyaktig bestemmelse av bakteriell kolonisering av rhizosfæren.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å oppnå god reproduserbarhet er det fire kritiske trinn for koloniseringsdeteksjonsprosessen til denne protokollen. For det første er det nødvendig å sikre at antall inokulerte bakterieceller er nøyaktig det samme i hvert eksperiment. For det andre er det også nødvendig å kontrollere den ukoloniserte bakterierengjøringsintensiteten med sterilt vann. For det tredje må hver prøvefortynningsprosess virves før den utføres for å la prøven være i fullstendig blandingstilstand for å unngå absorpsjonsfeil …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (32370135), innovasjonsprogrammet til Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-CSAL-202302), Science and Technology Project of Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
