Mätning av bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana-rötter i hydroponiskt tillstånd
Summary
Kolonisering av växttillväxtfrämjande rhizobakterier (PGPR) i rhizosfären är avgörande för dess tillväxtfrämjande effekt. Det är nödvändigt att standardisera metoden för detektion av bakteriell rhizosfärkolonisering. Här beskriver vi en reproducerbar metod för att kvantifiera bakteriell kolonisering på rotytan.
Abstract
Att mäta bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana-rot är ett av de vanligaste experimenten i studier av växt-mikrobinteraktion. En standardiserad metod för att mäta bakteriekolonisering i rhizosfären är nödvändig för att förbättra reproducerbarheten. Vi odlade först steril A.thaliana under hydroponiska förhållanden och inokulerade sedan bakteriecellerna i rhizosfären vid en slutlig koncentration av OD600 på 0,01. 2 dagar efter inokuleringen skördades rotvävnaden och tvättades tre gånger i sterilt vatten för att avlägsna de okoloniserade bakteriecellerna. Rötterna vägdes sedan och de bakterieceller som koloniserades på roten samlades in av virveln. Cellsuspensionen späddes ut i en gradient med en fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) buffert, följt av plätering på ett Luria-Bertani (LB) agarmedium. Plattorna inkuberades vid 37 °C i 10 timmar, och sedan räknades och normaliserades de enskilda kolonierna på LB-plattorna för att indikera vilka bakterieceller som koloniserats på rötterna. Denna metod används för att detektera bakteriell kolonisering i rhizosfären under monointeraktionsförhållanden, med god reproducerbarhet.
Introduction
Det finns kvantitativa och kvalitativa metoder för att detektera rhizosfärkolonisering av en enda bakteriestam. För den kvalitativa metoden bör en stam som konstitutivt uttrycker fluorescens användas, och fluorescensfördelningen och intensiteten bör undersökas med fluorescensmikroskopi eller laserkonfokala instrument 1,2. Dessa strategier kan mycket väl återspegla bakteriell kolonisering in situ3, men de är inte lika exakta som traditionella platträkningsmetoder i kvantifiering. Dessutom, på grund av begränsningen att endast visa partiella rotzoner under mikroskopet, kan det ibland påverkas av subjektiv bias.
Här beskriver vi en kvantitativ metod, som innebär att man samlar in de koloniserade bakteriecellerna och räknar de bakteriella CFU:erna på en platta. Denna metod är baserad på utspädning och plätering genom vilken de koloniserade stammar som avlägsnats från växtrötter kan räknas, och det totala antalet koloniserade bakterier på roten kan beräknas som 4,5.
Först odlades A. thaliana under hydroponiska förhållanden, och sedan inokulerades bakterieceller i rhizosfären vid en slutlig koncentration av 0,01 OD600. De infekterade rotvävnaderna skördades 2 dagar efter inokulering och tvättades i sterilt vatten för att avlägsna de okoloniserade bakteriecellerna. Vidare samlades bakterieceller koloniserade på roten, späddes ut i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert och pläterades på ett Luria-Bertani (LB) agarmedium. Efter inkubation vid 37 °C i 10 timmar räknades och normaliserades enstaka kolonier på LB-plattor för att bestämma vilka bakterieceller som koloniserades på rötterna.
Denna metod är mycket användbar, har god repeterbarhet och är mer lämplig för noggrann bestämning av bakteriell kolonisering av rhizosfären.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att uppnå god reproducerbarhet finns det fyra kritiska steg för koloniseringsdetekteringsprocessen för detta protokoll. För det första är det nödvändigt att se till att antalet inokulerade bakterieceller är exakt detsamma i varje experiment. För det andra är det också nödvändigt att kontrollera rengöringsintensiteten för de icke-koloniserade bakterierna med sterilt vatten. För det tredje måste varje provutspädningsprocess virvlas innan den utförs för att låta provet vara i ett fullständigt bla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (32370135), innovationsprogrammet för den kinesiska akademin för jordbruksvetenskap (CAAS-CSAL-202302), vetenskaps- och teknikprojektet vid Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
