4D lys-ark billeddannelse af zebrafisk hjertekontraktion
Summary
Denne protokol bruger lysbilleddannelse til at undersøge hjertekontraktil funktion hos zebrafisklarver og få indsigt i hjertemekanik gennem cellesporing og interaktiv analyse.
Abstract
Zebrafisk er en spændende modelorganisme kendt for sin bemærkelsesværdige hjerteregenereringskapacitet. At studere det kontraherende hjerte in vivo er afgørende for at få indsigt i strukturelle og funktionelle ændringer som reaktion på skader. Det er dog stadig udfordrende at opnå højopløselige og hurtige 4-dimensionelle (4D, 3D rumlige + 1D tidsmæssige) billeder af zebrafiskens hjerte for at vurdere hjertearkitektur og kontraktilitet. I denne sammenhæng bruges et internt lysarkmikroskop (LSM) og tilpasset beregningsanalyse til at overvinde disse tekniske begrænsninger. Denne strategi, der involverer LSM-systemkonstruktion, retrospektiv synkronisering, enkeltcellesporing og brugerrettet analyse, gør det muligt at undersøge mikrostrukturen og kontraktilfunktionen på tværs af hele hjertet ved enkeltcelleopløsningen i de transgene Tg (myl7: nucGFP) zebrafisklarver. Derudover er vi i stand til yderligere at inkorporere mikroinjektion af små molekyleforbindelser for at fremkalde hjerteskade på en præcis og kontrolleret måde. Samlet set giver denne ramme mulighed for at spore fysiologiske og patofysiologiske ændringer såvel som den regionale mekanik på enkeltcelleniveau under hjertemorfogenese og regenerering.
Introduction
Zebrafisken (Danio rerio) er en meget anvendt modelorganisme til studier af hjerteudvikling, fysiologi og reparation på grund af dens optiske gennemsigtighed, genetiske trækbarhed og regenerative kapacitet 1,2,3,4. Efter myokardieinfarkt, mens strukturelle og funktionelle ændringer påvirker hjerteudstødning og hæmodynamik, hindrer tekniske begrænsninger fortsat evnen til at undersøge den dynamiske proces under hjerteregenerering med den høje rumlige tidsopløsning. For eksempel har konventionelle billeddannelsesmetoder, såsom konfokal mikroskopi, begrænsninger med hensyn til billeddybde, tidsmæssig opløsning eller fototoksicitet til at fange de dynamiske ændringer og vurdere hjertekontraktil funktion under flere hjertecyklusser5.
Lysarkmikroskopi repræsenterer en avanceret billeddannelsesmetode, der med succes løser disse problemer ved hurtigt at feje laseren over hjertets ventrikel og atrium og opnå detaljerede billeder med forbedret rumlig tidsopløsning og ubetydelig fotoblegning og fototoksiske effekter 6,7,8,9,10,11.
Denne protokol introducerer en omfattende billeddannelsesstrategi, der inkluderer LSM-systemkonstruktion, 4D-billedrekonstruktion, 3D-cellesporing og interaktiv analyse for at fange og analysere dynamikken i kardiomyocytter på tværs af hele hjertet under flere hjertecyklusser12. Det tilpassede billeddannelsessystem og beregningsmetode gør det muligt at spore myokardiemikrostrukturen og kontraktilfunktionen på enkeltcelleniveau i transgene Tg (myl7: nucGFP) zebrafisklarver. Desuden blev små molekyleforbindelser leveret til embryonerne ved hjælp af mikroinjektion for at vurdere lægemiddelinduceret hjerteskade og efterfølgende regenerering. Denne holistiske strategi giver et indgangspunkt til in vivo at undersøge strukturelle, funktionelle og mekaniske egenskaber af myokardium på enkeltcelleniveau under hjerteudvikling og regenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Integrationen af zebrafiskmodellen med tekniske metoder rummer et enormt potentiale for in vivo-udforskning af myokardieinfarkt, arytmi og medfødte hjertefejl. Ved at udnytte sin optiske gennemsigtighed, regenerative kapacitet og genetiske og fysiologiske ligheder med mennesker er zebrafiskembryoner og larver blevet meget brugt i forskning 1,2,4. Den overlegne rumlige tidsmæssige opløsning, minimale fotoskader og opt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi udtrykker vores taknemmelighed over for Dr. Caroline Burns på Boston Children’s Hospital for generøst at dele den transgene zebrafisk. Vi takker fru Elizabeth Ibanez for hendes hjælp med at opdrætte zebrafisk på UT Dallas. Vi sætter også pris på alle de konstruktive kommentarer fra D-inkubatormedlemmer på UT Dallas. Dette arbejde blev støttet af NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) og UT Dallas STARS-programmet (Y.D.).
Materials
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER |
| Animal models | ||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 |
| Software and algorithms | ||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 |
| Light-sheet system | ||
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A |
| 4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 |
| 20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU |
| Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 |
| Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M |
| Rotation stepper motor | Pololu | 1474 |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX |
| Microinjector and vacuum pump | ||
| Microinjector | WPI | PV850 |
| Vacuum pump | Welch | 2522B-01 |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT |
| Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 |
| Virtual reality hardware | ||
| VR headset | Meta | Quest 2 |
| 30mg/L PTU solution | ||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 |
| 1X E3 working solution | – | – |
| 1% Agarose | – | – |
| Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 |
| Deionized water | – | – |
| 10g/L Tricaine stock solution | ||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 |
| Deionized water | – | – |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 |
| 150mg/L Tricaine working solution | ||
| 10g/L Tricaine stock solution | – | – |
| Deionized water | – | – |
| 60X E3 stock solution | ||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl |
| Potassium Chloride | – | KCL |
| Calcium Chloride Dihydrate | – | CaCL2 x 2H2O |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | – | MgSO4 x 7H2O |
| RO Water | – | – |
| 1X E3 working solution | ||
| 60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | – |
| RO Water | – | – |
| 1% Methylene Blue (optional) | – | C16H18ClN3S |
References
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870 (2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244 (2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15 (2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227 (2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828 (2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801 (2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278 (2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112 (2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J. Opt. 20 (5), 053002 (2018).
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763 (2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187 (2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565 (2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225 (2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291 (2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180 (2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854 (2022).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).
