Kationisk nanoemulsjon-innkapslet retinsyre som en adjuvans for å fremme OVA-spesifikke systemiske og slimhinneresponser
Summary
I denne protokollen utviklet vi en kationisk nanoemulsjon-innkapslet retinsyre (RA) som skal brukes som en adjuvans for å fremme antigenspesifikke systemiske og mukosale responser. Ved å legge til FDA-godkjent RA til nanoemulsjonen ble antigen-spesifikk sIgA fremmet i skjeden og tynntarmen etter intramuskulær injeksjon av nanoemulsjonen.
Abstract
Kationiske nanostrukturer har dukket opp som et adjuvans og antigenleveringssystem som forbedrer dendritisk cellemodning, ROS-generering og antigenopptak og fremmer deretter antigenspesifikke immunresponser. I de senere år har retinsyre (RA) fått økende oppmerksomhet på grunn av sin effekt ved å aktivere slimhinneimmunresponsen; For å kunne bruke RA som slimhinneadjuvans, er det imidlertid nødvendig å løse problemet med oppløsning, lasting og levering. Her beskriver vi et kationisk nanoemulsjon-innkapslet retinsyre (CNE-RA) leveringssystem sammensatt av det kationiske lipidet 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOTAP), retinsyre, skvalen som oljefase, polysorbat 80 som overflateaktivt middel og sorbitantrioleat 85 som co-overflateaktivt middel. Dens fysiske og kjemiske egenskaper ble karakterisert ved hjelp av dynamisk lysspredning og et spektrofotometer. Immunisering av mus med blandingen av antigen (ovalbumin, OVA) og CNE-RA økte signifikant nivåene av anti-OVA-sekretorisk immunoglobulin A (sIgA) i vaginal skyllevæske og tynntarmsskyllevæske hos mus sammenlignet med OVA alene. Denne protokollen beskriver en detaljert metode for fremstilling, karakterisering og evaluering av den adjuvante effekten av CNE-RA.
Introduction
Adjuvans brukes ofte til å forbedre effekten av en vaksine ved å stimulere immunsystemet til å reagere sterkere på vaksinen, og dermed øke immuniteten mot et bestemt patogen1. Nanoemulsjon (NE) adjuvans refererer til et kolloidalt dispersjonssystem med termodynamisk stabilitet ved å emulgere en viss andel oljefase og vandig fase for å produsere en emulsjon i form av vann-i-olje (W / O) eller olje-i-vann (O / W) 2. O / W nanoemulsjonsadjuvans kan produsere cytokiner og kjemokiner på injeksjonsstedet, indusere rask aggregering og spredning av viktige immunceller som monocytter, nøytrofiler og eosinofiler, og forbedre immunresponsen og forbedre immunogeniteten til antigener3. For tiden har tre nanoemulsjonsadjuvanser (MF59, AS03 og AF03) blitt lisensiert for bruk i vaksiner og har vist god sikkerhet og effekt4.
Imidlertid har slimhinneimmunitet blitt dårlig ivaretatt av de nåværende godkjente adjuvante formuleringene i konvensjonell parenteral vaksinasjon5. Retinsyre (RA) har blitt rapportert å indusere intestinal homing av immunceller, men dens lave polaritet, dårlig oppløselighet i vann og dårlig lys og termisk stabilitet begrenser bruken til robust enterisk vaksinasjon. Nanoemulsjoner gir muligheter til å øke biotilgjengeligheten av svært lipofile stoffer, og oljekjernen av O / W-emulsjonsadjuvanser er egnet for oppløsning av ikke-polare stoffer som RA6. Derfor kan nanoemulsjoner brukes som bærere for RA for å oppnå den doble responseffekten av systemisk immunitet og slimhinneimmunitet.
Sammenlignet med nøytrale eller anioniske leveringssystemer har kationiske leveringssystemer relativt effektive antigeninnkapslings- og leveringsevner, noe som kan forbedre immunogeniteten til antigener 7,8,9. Den kationiske overflateladningen til en rekke adjuvante systemer er viktig for deres adjuvante effekter 10,11,12. Den kationiske ladningen er en viktig faktor for å forlenge vaksineretensjonen på injeksjonsstedet, øke antigenpresentasjonen og forlenge stimuleringen av cellulær immunitet i kroppen12.
Basert på de ovennevnte betraktningene utviklet vi en kationisk nanoemulsjon for effektivt å levere RA og antigener. Partikkelstørrelsen og zetapotensialet til nanoemulsjonen ble bestemt ved bruk av dynamisk lysspredning (DLS), og de systemiske og mukosale immunresponsene til nanoemulsjonen kombinert med OVA ble evaluert ved intramuskulær injeksjon13.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen utviklet vi en kationisk nanoemulsjon-innkapslet retinsyre som skal brukes som en adjuvans for å fremme antigenspesifikke systemiske og mukosale responser. Sammenlignet med tradisjonelle NE-adjuvanser har den følgende to fordeler. For det første har overflaten av O / W NE generelt en høy negativ ladning, noe som gjør det vanskelig å laste antigener direkte. Kationiske NØ kan effektivt adsorbere peptid- eller proteinantigener og forbedre den spesifikke immunogenisiteten. For det andre har erfari…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) og Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 32270988).
Materials
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O’Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. Traversing the skin barrier with nano-emulsions. Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
