التكيف في أقصى درجات الحياة: التطور التجريبي مع الأركيون المتطرف Sulfolobus acidocaldarius
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول تطور تجريبي للتكيف في المحبة للحرارة باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة كحاضنات. يتم توضيح هذه التقنية من خلال توصيف التكيف مع درجة الحرارة في Sulfolobus acidocaldarius ، وهو أثري بدرجة حرارة نمو مثالية تبلغ 75 درجة مئوية.
Abstract
برز الأركيون Sulfolobus acidocaldarius كنظام نموذجي واعد للحرارة. يعد التحقيق في كيفية تكيف المحبة للحرارة مع درجات الحرارة المتغيرة مطلبا رئيسيا ، ليس فقط لفهم العمليات التطورية الأساسية ولكن أيضا لتطوير S. acidocaldarius كهيكل للهندسة الحيوية. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية أمام إجراء التطور التجريبي مع المحبة للحرارة في تكلفة صيانة المعدات واستخدام الطاقة للحاضنات التقليدية للنمو في درجات الحرارة العالية. لمواجهة هذا التحدي ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي شامل لإجراء التطور التجريبي في S. acidocaldarius ، باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة. يتضمن البروتوكول تقنية استزراع دفعي بأحجام صغيرة نسبيا (1.5 مل) ، مما يتيح تتبع التكيف في سلالات مستقلة متعددة. هذه الطريقة قابلة للتطوير بسهولة من خلال استخدام خلاطات حرارية إضافية. مثل هذا النهج يزيد من إمكانية الوصول إلى S. acidocaldarius كنظام نموذجي عن طريق تقليل كل من الاستثمار الأولي والتكاليف الجارية المرتبطة بالتحقيقات التجريبية. علاوة على ذلك ، يمكن نقل هذه التقنية إلى أنظمة ميكروبية أخرى لاستكشاف التكيف مع الظروف البيئية المتنوعة.
Introduction
قد تكون الحياة المبكرة على الأرض قد نشأت في بيئات قاسية ، مثل الفتحات الحرارية المائية ، والتي تتميز بدرجات حرارة وحموضة عالية للغاية1. تستمر الميكروبات في العيش في البيئات القاسية ، بما في ذلك الينابيع الساخنة والصولفاتارا البركانية. إن توصيف الديناميات التطورية التي تحدث في ظل هذه الظروف القاسية قد يلقي الضوء على العمليات الفسيولوجية المتخصصة التي تمكن من البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف. وقد يكون لذلك آثار واسعة النطاق، من فهمنا لأصول التنوع البيولوجي إلى تطوير إنزيمات جديدة ذات درجة حرارة عالية مع تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.
لا يزال فهم الديناميات التطورية الميكروبية في البيئات القاسية محدودا على الرغم من أهميته الحاسمة. في المقابل ، تم اكتساب مجموعة كبيرة من المعرفة حول التطور في البيئات متوسطة الحجم من خلال تطبيق تقنية تعرف باسم التطور التجريبي. يتضمن التطور التجريبي مراقبة التغير التطوري في ظل ظروف المختبر2،3،4،5. وغالبا ما ينطوي ذلك على بيئة تغيير محددة (مثل درجة الحرارة والملوحة وإدخال مادة سامة أو كائن منافس)7،8،9. عندما يقترن التطور التجريبي بتسلسل الجينوم الكامل ، فقد مكننا من اختبار الجوانب الرئيسية للعمليات التطورية ، بما في ذلك التوازي والتكرار والأساس الجينومي للتكيف. ومع ذلك ، حتى الآن ، تم إجراء الجزء الأكبر من التطور التجريبي باستخدام الميكروبات متوسطة الحجم (بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات2،3،4،5 ، ولكن باستثناء العتائق إلى حد كبير). ستمكننا طريقة التطور التجريبي المطبقة على الميكروبات المحبة للحرارة من فهم كيفية تطورها بشكل أفضل والمساهمة في فهم أكثر شمولا للتطور. ومن المحتمل أن يكون لهذا آثار واسعة النطاق ، من فك رموز أصول الحياة المحبة للحرارة على الأرض إلى تطبيقات التكنولوجيا الحيوية التي تنطوي على “الإنزيمات المتطرفة” المستخدمة في العمليات الحيوية ذات درجة الحرارةالعالية 10 والبحوث البيولوجية الفلكية11.
يعتبر الأركيون Sulfolobus acidocaldarius مرشحا مثاليا ككائن نموذجي لتطوير تقنيات التطور التجريبية لمحبي الحرارة. تتكاثر S. acidocaldarius هوائيا ، مع درجة حرارة نمو مثالية عند 75 درجة مئوية (نطاق 55 درجة مئوية إلى 85 درجة مئوية) وحموضة عالية (درجة الحموضة 2-3) 4،6،12،13،14. بشكل ملحوظ ، على الرغم من ظروف نموها القاسية ، تحافظ S. acidocaldarius على الكثافة السكانية ومعدلات الطفرات المماثلة للميسوفيل7،15،16،17،18. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يمتلك جينوم صغير نسبيا ومشروح جيدا (سلالة DSM639: 2.2 ميجا بايت ، 36.7٪ GC ، 2347 جينا)12 ؛ تستفيد S. acidocaldarius أيضا من أدوات هندسة الجينوم القوية ، مما يسمح بإجراء تقييم مباشر للعملية التطورية من خلال الضربات القاضية الجينية المستهدفة19. ومن الأمثلة البارزة على ذلك توافر سلالات معدلة وراثيا من S. acidocaldarius ، مثل سلالات uracil auxotrophic من MW00119 و SK-120 ، والتي يمكن أن تكون بمثابة علامات قابلة للاختيار.
هناك تحديات كبيرة في إجراء التطور التجريبي مع محبة للحرارة مثل S. acidocaldarius. تفرض الحضانة الممتدة في درجات الحرارة العالية المطلوبة لهذه الدراسات تبخرا كبيرا لكل من تقنيات الاستزراع السائل والصلب. يمكن أن يؤدي التشغيل الممتد في درجات حرارة عالية أيضا إلى إتلاف حاضنات الاهتزاز التقليدية التي يشيع استخدامها في التطور التجريبي في الوسائط السائلة. يتطلب استكشاف درجات حرارة متعددة استثمارا ماليا كبيرا للحصول على العديد من الحاضنات وصيانتها. علاوة على ذلك ، فإن ارتفاع استهلاك الطاقة المطلوب يثير مخاوف بيئية ومالية كبيرة.
يقدم هذا العمل طريقة لمواجهة التحديات التي واجهتها في إجراء التطور التجريبي مع محبة للحرارة مثل S. acidocaldarius. بناء على تقنية طورها Baes et al. للتحقيق في استجابة الصدمات الحرارية14,21 ، تستخدم الطريقة التي تم تطويرها هنا خلاطات حرارية على مقاعد البدلاء من أجل حضانة متسقة وموثوقة في درجات الحرارة العالية. تسمح قابليتها للتوسع بالتقييم المتزامن لمعالجات درجات الحرارة المتعددة ، مع انخفاض تكاليف الحصول على معدات حضانة إضافية. هذا يعزز الكفاءة التجريبية ، مما يتيح التحليل الإحصائي القوي والتحقيق المكثف في العوامل التي تؤثر على الديناميات التطورية في محبة الحرارة22. علاوة على ذلك ، يقلل هذا النهج بشكل كبير من الاستثمار الأولي المالي واستهلاك الطاقة مقارنة بالحاضنات التقليدية ، مما يوفر بديلا أكثر استدامة وصديقة للبيئة.
تضع طريقتنا الأساس للتحقيق التجريبي في الديناميات التطورية في البيئات التي تتميز بدرجات حرارة قصوى ، والتي ربما لعبت دورا رئيسيا خلال المراحل المبكرة من تنويع الحياة على الأرض. تتمتع الكائنات المحبة للحرارة بخصائص فريدة ، لكن ظروف نموها الشديدة ومتطلباتها المتخصصة غالبا ما تحد من إمكانية الوصول إليها كنظام نموذجي. إن التغلب على هذه الحواجز لا يوسع فرص البحث للتحقيق في الديناميات التطورية فحسب ، بل يعزز أيضا الفائدة الأوسع لمحبي الحرارة كأنظمة نموذجية في البحث العلمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طور هذا العمل بروتوكول تطور تجريبي لمحبي الحرارة ، مصمم هنا ل Archaion S. acidocaldarius ، ولكنه قابل للتكيف مع الميكروبات الأخرى ذات متطلبات النمو ذات درجات الحرارة العالية. يعتمد هذا البروتوكول على التقنيات المصممة في البداية للبكتيريا متوسطة الحجم ولكن تم تعديلها خصيصا للت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون البروفيسور SV Albers (جامعة فرايبورغ) ، والبروفيسور إيفلين بيترز (Vrije Universiteit Brussel) ، والدكتور راني بايس (Vrije Universiteit Brussel) على المشورة وسلالة S. acidocaldarius DSM639. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الملكية (الممنوحة ل DRG: RGS \ R1 \ 231308) ، ومنحة أبحاث UKRI-NERC “استكشاف الحدود” (الممنوحة ل DRG و CGK: NE / X012662 / 1) ، ومنحة الدكتوراه من جامعة الكويت (الممنوحة ل ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
References
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
- McDonald, M. J. Microbial experimental evolution – a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992 (2019).
- Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
- McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
- Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
- Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
- Peeters, E., Thia-Toong, T. -. L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
- Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -. V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus – A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474 (2017).
- Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
- Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
- Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532 (2021).
- Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
- Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
- Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605 (2015).
- Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520 (2009).
- Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
- Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214 (2012).
- Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
- Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322 (2023).
- González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
- Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- . Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master’s Thesis Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018)
- Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
- Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8 (2018).
- Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791 (2017).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
