Tilpasning i livets yderpunkter: Eksperimentel evolution med den ekstremofile arkæon Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Her præsenterer vi en eksperimentel evolutionsprotokol til tilpasning i termofiler ved hjælp af billige, energieffektive bordtermomixere som inkubatorer. Teknikken demonstreres gennem karakterisering af temperaturtilpasning i Sulfolobus acidocaldarius, en arkæon med en optimal væksttemperatur på 75 °C.
Abstract
Arkæonen Sulfolobus acidocaldarius er dukket op som et lovende termofilt modelsystem. At undersøge, hvordan termofiler tilpasser sig skiftende temperaturer, er et nøglekrav, ikke kun for at forstå grundlæggende evolutionære processer, men også for at udvikle S. acidocaldarius som et chassis for bioteknologi. En stor hindring for at udføre eksperimentel evolution med termofiler er udgifterne til vedligeholdelse af udstyr og energiforbrug af traditionelle inkubatorer til højtemperaturvækst. For at løse denne udfordring præsenteres en omfattende eksperimentel protokol til udførelse af eksperimentel evolution i S. acidocaldarius , der bruger billige og energieffektive bordtermoblandere. Protokollen involverer en batchkulturteknik med relativt små volumener (1,5 ml), hvilket muliggør sporing af tilpasning i flere uafhængige afstamninger. Denne metode er let skalerbar ved brug af yderligere termoblandere. En sådan tilgang øger tilgængeligheden af S. acidocaldarius som modelsystem ved at reducere både initialinvesteringer og løbende omkostninger forbundet med eksperimentelle undersøgelser. Desuden kan teknikken overføres til andre mikrobielle systemer til at udforske tilpasning til forskellige miljøforhold.
Introduction
Tidligt liv på Jorden kan være opstået i ekstreme miljøer, såsom hydrotermiske ventiler, som er kendetegnet ved ekstremt høje temperaturer og surhedsgrad1. Mikrober fortsætter med at bebo ekstreme miljøer, herunder varme kilder og vulkansk solfatara. Karakterisering af den evolutionære dynamik, der opstår under disse ekstreme forhold, kan kaste lys over de specialiserede fysiologiske processer, der muliggør overlevelse under disse forhold. Dette kan have vidtrækkende konsekvenser, fra vores forståelse af oprindelsen af biologisk mangfoldighed til udviklingen af nye højtemperaturenzymer med bioteknologiske anvendelser.
Forståelsen af mikrobiel evolutionær dynamik i ekstreme miljøer er fortsat begrænset på trods af dens kritiske betydning. I modsætning hertil er en betydelig mængde viden om evolution i mesofile miljøer blevet erhvervet gennem anvendelsen af en teknik kendt som eksperimentel evolution. Eksperimentel evolution involverer observation af evolutionære ændringer under laboratorieforhold 2,3,4,5. Ofte involverer dette et defineret ændringsmiljø (f.eks. temperatur, saltholdighed, introduktion af et toksin eller en konkurrerende organisme)7,8,9. Når det kombineres med helgenomsekventering, har eksperimentel evolution gjort det muligt for os at teste nøgleaspekter af evolutionære processer, herunder parallelitet, repeterbarhed og det genomiske grundlag for tilpasning. Til dato er størstedelen af den eksperimentelle evolution imidlertid blevet udført med mesofile mikrober (herunder bakterier, svampe og vira 2,3,4,5, men stort set eksklusive arkæer). En metode til eksperimentel evolution, der kan anvendes på termofile mikrober, vil gøre os i stand til bedre at forstå, hvordan de udvikler sig og bidrage til en mere omfattende forståelse af evolution. Dette har potentielt vidtrækkende konsekvenser, fra dechifrering af oprindelsen af termofilt liv på Jorden til bioteknologiske anvendelser, der involverer ‘ekstremozymer’, der bruges i højtemperaturbioprocesser10 og astrobiologisk forskning11.
Arkæonen Sulfolobus acidocaldarius er en ideel kandidat som modelorganisme til udvikling af eksperimentelle evolutionsteknikker til termofiler. S. acidocaldarius formerer sig aerobt med en optimal væksttemperatur ved 75 °C (interval 55 °C til 85 °C) og høj surhedsgrad (pH 2-3)4,6,12,13,14. Bemærkelsesværdigt nok, på trods af sine ekstreme vækstbetingelser, opretholder S. acidocaldarius populationstætheder og mutationsrater, der kan sammenlignes med mesofile 7,15,16,17,18. Derudover besidder den et relativt lille, velkommenteret genom (stamme DSM639: 2,2 Mb, 36,7 % GC, 2.347 gener)12; S. acidocaldarius drager også fordel af robuste genomtekniske værktøjer, der giver mulighed for en direkte vurdering af den evolutionære proces gennem målrettede gen-knockouts19. Et bemærkelsesværdigt eksempel på dette er tilgængeligheden af genetisk modificerede stammer af S. acidocaldarius, såsom de uracil auxotrofiske stammer af MW00119 og SK-120, som kan tjene som selekterbare markører.
Der er betydelige udfordringer med at udføre eksperimentel evolution med termofiler som S. acidocaldarius. Udvidet inkubation ved høje temperaturer, der kræves til disse undersøgelser, medfører betydelig fordampning for både flydende og faste dyrkningsteknikker. Langvarig drift ved høje temperaturer kan også beskadige de traditionelle rysteinkubatorer, der almindeligvis bruges i eksperimentel evolution i flydende medier. At udforske flere temperaturer kræver en betydelig økonomisk investering for at erhverve og vedligeholde flere inkubatorer. Desuden giver det høje energiforbrug, der kræves, anledning til betydelige miljømæssige og finansielle bekymringer.
Dette arbejde introducerer en metode til at adressere de udfordringer, der opstår ved at udføre eksperimentel evolution med termofiler som S. acidocaldarius. Med udgangspunkt i en teknik udviklet af Baes et al. til undersøgelse af varmechokrespons14,21, bruger den metode, der er udviklet her, bord-top termomixere til ensartet og pålidelig højtemperaturinkubation. Dens skalerbarhed giver mulighed for samtidig vurdering af flere temperaturbehandlinger med reducerede omkostninger ved anskaffelse af yderligere inkubationsudstyr. Dette forbedrer eksperimentel effektivitet, hvilket muliggør robust statistisk analyse og omfattende undersøgelse af faktorer, der påvirker evolutionær dynamik i termofiler22. Desuden reducerer denne tilgang den økonomiske startinvestering og energiforbruget betydeligt sammenlignet med traditionelle væksthuse og tilbyder et mere bæredygtigt og miljøvenligt alternativ.
Vores metode lægger grunden til eksperimentelt at undersøge evolutionær dynamik i miljøer præget af ekstreme temperaturer, som kan have spillet en nøglerolle i de tidlige stadier af diversificeringen af livet på Jorden. Termofile organismer har unikke egenskaber, men deres ekstreme vækstbetingelser og specialiserede krav har ofte begrænset deres tilgængelighed som modelsystem. At overvinde disse barrierer udvider ikke kun forskningsmulighederne for at undersøge evolutionær dynamik, men forbedrer også den bredere anvendelighed af termofiler som modelsystemer i videnskabelig forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde har udviklet en eksperimentel evolutionsprotokol for termofiler, her skræddersyet til arkæonen S. acidocaldarius, men som kan tilpasses andre mikrober med høje temperaturvækstkrav. Denne protokol bygger på teknikker, der oprindeligt blev designet til mesofile bakterier, men er specifikt modificeret for at overvinde de tekniske udfordringer forbundet med aerob vækst ved høje temperaturer 2,4,5,24.<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker professor SV Albers (Universitetet i Freiburg), professor Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) og Dr. Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) for råd og S. acidocaldarius DSM639-stammen. Dette arbejde blev finansieret af et Royal Society Research Grant (tildelt DRG: RGS\R1\231308), et UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” Research Grant (tildelt DRG og CGK: NE/X012662/1) og et Kuwait University PhD-stipendium (tildelt ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
References
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
- McDonald, M. J. Microbial experimental evolution – a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992 (2019).
- Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
- McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
- Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
- Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
- Peeters, E., Thia-Toong, T. -. L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
- Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -. V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus – A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474 (2017).
- Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
- Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
- Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532 (2021).
- Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
- Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
- Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605 (2015).
- Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520 (2009).
- Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
- Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214 (2012).
- Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
- Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322 (2023).
- González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
- Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- . Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master’s Thesis Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018)
- Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
- Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8 (2018).
- Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791 (2017).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
