Aanpassing aan de uitersten van het leven: experimentele evolutie met de extremofiele Archaeon Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Hier presenteren we een experimenteel evolutieprotocol voor aanpassing bij thermofielen met behulp van goedkope, energiezuinige bench-top thermomixers als incubatoren. De techniek wordt gedemonstreerd door de karakterisering van temperatuuraanpassing in Sulfolobus acidocaldarius, een archaeon met een optimale groeitemperatuur van 75 °C.
Abstract
Het archaeon Sulfolobus acidocaldarius heeft zich ontpopt als een veelbelovend thermofiel modelsysteem. Onderzoek naar hoe thermofielen zich aanpassen aan veranderende temperaturen is een belangrijke vereiste, niet alleen voor het begrijpen van fundamentele evolutionaire processen, maar ook voor het ontwikkelen van S. acidocaldarius als een chassis voor bio-engineering. Een groot obstakel voor het uitvoeren van experimentele evolutie met thermofielen zijn de kosten van het onderhoud van de apparatuur en het energieverbruik van traditionele incubatoren voor groei bij hoge temperaturen. Om deze uitdaging aan te gaan, wordt een uitgebreid experimenteel protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van experimentele evolutie in S. acidocaldarius , waarbij gebruik wordt gemaakt van goedkope en energiezuinige bench-top thermomixers. Het protocol omvat een batchcultuurtechniek met relatief kleine volumes (1,5 ml), waardoor aanpassing in meerdere onafhankelijke afstammingslijnen kan worden gevolgd. Deze methode is gemakkelijk schaalbaar door het gebruik van extra thermomixers. Een dergelijke benadering vergroot de toegankelijkheid van S. acidocaldarius als modelsysteem door zowel de initiële investering als de lopende kosten in verband met experimenteel onderzoek te verminderen. Bovendien is de techniek overdraagbaar naar andere microbiële systemen voor het onderzoeken van aanpassing aan diverse omgevingsomstandigheden.
Introduction
Het vroege leven op aarde is mogelijk ontstaan in extreme omgevingen, zoals hydrothermale bronnen, die worden gekenmerkt door extreem hoge temperaturen enzuurgraad1. Microben blijven extreme omgevingen bewonen, waaronder warmwaterbronnen en vulkanische solfatara. Het karakteriseren van de evolutionaire dynamiek die zich onder deze extreme omstandigheden voordoet, kan licht werpen op de gespecialiseerde fysiologische processen die overleving onder deze omstandigheden mogelijk maken. Dit kan verstrekkende implicaties hebben, van ons begrip van de oorsprong van biologische diversiteit tot de ontwikkeling van nieuwe hoge-temperatuurenzymen met biotechnologische toepassingen.
Het begrip van microbiële evolutionaire dynamiek in extreme omgevingen blijft beperkt, ondanks het cruciale belang ervan. Daarentegen is een aanzienlijke hoeveelheid kennis over evolutie in mesofiele omgevingen verworven door de toepassing van een techniek die bekend staat als experimentele evolutie. Experimentele evolutie omvat het observeren van evolutionaire verandering onder laboratoriumomstandigheden 2,3,4,5. Vaak gaat het om een gedefinieerde veranderingsomgeving (bijv. temperatuur, zoutgehalte, introductie van een toxine of een concurrerend organisme)7,8,9. In combinatie met sequencing van het hele genoom heeft experimentele evolutie ons in staat gesteld om belangrijke aspecten van evolutionaire processen te testen, waaronder parallellisme, herhaalbaarheid en de genomische basis voor aanpassing. Tot op heden is het grootste deel van de experimentele evolutie echter uitgevoerd met mesofiele microben (inclusief bacteriën, schimmels en virussen 2,3,4,5, maar grotendeels exclusief archaea). Een methode voor experimentele evolutie die van toepassing is op thermofiele microben zou ons in staat stellen beter te begrijpen hoe ze evolueren en bijdragen aan een beter begrip van evolutie. Dit heeft potentieel verstrekkende implicaties, van het ontcijferen van de oorsprong van thermofiel leven op aarde tot biotechnologische toepassingen met ‘extremozymen’ die worden gebruikt in bioprocessen op hoge temperatuur10 en astrobiologisch onderzoek11.
Het archaeon Sulfolobus acidocaldarius is een ideale kandidaat als modelorganisme voor het ontwikkelen van experimentele evolutietechnieken voor thermofielen. S. acidocaldarius plant zich aëroob voort, met een optimale groeitemperatuur bij 75 °C (bereik 55 °C tot 85 °C) en een hoge zuurgraad (pH 2-3) 4,6,12,13,14. Opmerkelijk is dat S. acidocaldarius, ondanks zijn extreme groeiomstandigheden, populatiedichtheden en mutatiesnelheden behoudt die vergelijkbaar zijn met die van mesofielen 7,15,16,17,18. Bovendien heeft het een relatief klein, goed geannoteerd genoom (stam DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 genen)12; S. acidocaldarius profiteert ook van robuuste hulpmiddelen voor genoomengineering, waardoor een directe beoordeling van het evolutionaire proces mogelijk is door middel van gerichte gen-knock-outs19. Een opmerkelijk voorbeeld hiervan is de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen van S. acidocaldarius, zoals de uracil-auxotrofe stammen van MW00119 en SK-120, die als selecteerbare merkers kunnen dienen.
Er zijn aanzienlijke uitdagingen bij het uitvoeren van experimentele evolutie met thermofielen zoals S. acidocaldarius. De voor deze studies vereiste langdurige incubatie bij hoge temperaturen impliceert een aanzienlijke verdamping voor zowel vloeibare als vaste kweektechnieken. Langdurig gebruik bij hoge temperaturen kan ook schade toebrengen aan de traditionele schudincubatoren die vaak worden gebruikt in experimentele evolutie in vloeibare media. Het verkennen van meerdere temperaturen vereist een aanzienlijke financiële investering voor het verwerven en onderhouden van meerdere incubatoren. Bovendien roept het hoge energieverbruik dat nodig is aanzienlijke milieu- en financiële zorgen op.
Dit werk introduceert een methode om de uitdagingen aan te pakken die zich voordoen bij het uitvoeren van experimentele evolutie met thermofielen zoals S. acidocaldarius. Voortbouwend op een techniek ontwikkeld door Baes et al. voor het onderzoeken van hitteschokrespons14,21, maakt de hier ontwikkelde methode gebruik van bench-top thermomixers voor consistente en betrouwbare incubatie bij hoge temperatuur. De schaalbaarheid maakt de gelijktijdige beoordeling van meerdere temperatuurbehandelingen mogelijk, met lagere kosten voor de aanschaf van extra incubatieapparatuur. Dit verbetert de experimentele efficiëntie, waardoor robuuste statistische analyse en uitgebreid onderzoek mogelijk worden naar factoren die de evolutionaire dynamiek bij thermofielen beïnvloeden22. Bovendien vermindert deze aanpak de financiële initiële investering en het energieverbruik aanzienlijk in vergelijking met traditionele incubatoren, waardoor een duurzamer en milieuvriendelijker alternatief wordt geboden.
Onze methode legt de basis voor experimenteel onderzoek naar evolutionaire dynamiek in omgevingen die worden gekenmerkt door extreme temperaturen, die mogelijk een sleutelrol hebben gespeeld tijdens de vroege stadia van de diversificatie van het leven op aarde. Thermofiele organismen hebben unieke eigenschappen, maar hun extreme groeiomstandigheden en gespecialiseerde vereisten hebben hun toegankelijkheid als modelsysteem vaak beperkt. Het overwinnen van deze barrières vergroot niet alleen de onderzoeksmogelijkheden voor het onderzoeken van evolutionaire dynamiek, maar vergroot ook het bredere nut van thermofielen als modelsystemen in wetenschappelijk onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk heeft een experimenteel evolutieprotocol voor thermofielen ontwikkeld, hier op maat gemaakt voor de archaeon S. acidocaldarius, maar aanpasbaar aan andere microben met hoge groeivereisten. Dit protocol bouwt voort op technieken die oorspronkelijk zijn ontworpen voor mesofiele bacteriën, maar is specifiek aangepast om de technische uitdagingen te overwinnen die gepaard gaan met aerobe groei op hoge temperatuur 2,4,5,24.<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken prof. dr. SV Albers (Universiteit van Freiburg), prof. dr. Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) en dr. Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) voor hun advies en de S. acidocaldarius DSM639 stam. Dit werk werd gefinancierd door een Royal Society Research Grant (toegekend aan DRG: RGS\R1\231308), een UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” Research Grant (toegekend aan DRG en CGK: NE/X012662/1), en een Kuwait University PhD-beurs (toegekend aan ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
References
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
- McDonald, M. J. Microbial experimental evolution – a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992 (2019).
- Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
- McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
- Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
- Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
- Peeters, E., Thia-Toong, T. -. L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
- Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -. V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus – A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474 (2017).
- Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
- Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
- Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532 (2021).
- Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
- Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
- Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605 (2015).
- Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520 (2009).
- Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
- Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214 (2012).
- Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
- Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322 (2023).
- González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
- Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- . Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master’s Thesis Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018)
- Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
- Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8 (2018).
- Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791 (2017).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
