Adaptation aux extrêmes de la vie : évolution expérimentale avec l’archéon extrêmophile Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Ici, nous présentons un protocole d’évolution expérimental pour l’adaptation chez les thermophiles en utilisant des thermomélangeurs de paillasse peu coûteux et économes en énergie comme incubateurs. La technique est démontrée par la caractérisation de l’adaptation à la température chez Sulfolobus acidocaldarius, un archéon avec une température de croissance optimale de 75 °C.
Abstract
L’archéon Sulfolobus acidocaldarius est apparu comme un système modèle thermophile prometteur. L’étude de la façon dont les thermophiles s’adaptent aux changements de température est une exigence clé, non seulement pour comprendre les processus évolutifs fondamentaux, mais aussi pour développer S. acidocaldarius en tant que châssis pour la bio-ingénierie. L’un des principaux obstacles à la réalisation d’une évolution expérimentale avec des thermophiles est le coût de l’entretien de l’équipement et la consommation d’énergie des incubateurs traditionnels pour la croissance à haute température. Pour relever ce défi, un protocole expérimental complet pour mener à bien l’évolution expérimentale de S. acidocaldarius est présenté, en utilisant des thermomélangeurs de paillasse peu coûteux et économes en énergie. Le protocole implique une technique de culture par lots avec des volumes relativement faibles (1,5 ml), permettant le suivi de l’adaptation dans plusieurs lignées indépendantes. Cette méthode est facilement évolutive grâce à l’utilisation de thermomélangeurs supplémentaires. Une telle approche augmente l’accessibilité de S. acidocaldarius en tant que système modèle en réduisant à la fois l’investissement initial et les coûts permanents associés aux investigations expérimentales. De plus, la technique est transférable à d’autres systèmes microbiens pour explorer l’adaptation à diverses conditions environnementales.
Introduction
Les premières conditions de vie sur Terre peuvent provenir d’environnements extrêmes, tels que les cheminées hydrothermales, qui se caractérisent par des températures et une acidité extrêmement élevées1. Les microbes continuent d’habiter des environnements extrêmes, notamment les sources chaudes et les solfatares volcaniques. La caractérisation de la dynamique évolutive qui se produit dans ces conditions extrêmes peut mettre en lumière les processus physiologiques spécialisés qui permettent la survie dans ces conditions. Cela peut avoir des implications très diverses, allant de notre compréhension des origines de la diversité biologique au développement de nouvelles enzymes à haute température ayant des applications biotechnologiques.
La compréhension de la dynamique évolutive microbienne dans des environnements extrêmes reste limitée malgré son importance cruciale. En revanche, un ensemble important de connaissances sur l’évolution dans les environnements mésophiles a été acquis grâce à l’application d’une technique connue sous le nom d’évolution expérimentale. L’évolution expérimentale consiste à observer le changement évolutif dans des conditions de laboratoire 2,3,4,5. Souvent, il s’agit d’un environnement de changement défini (p. ex., température, salinité, introduction d’une toxine ou d’un organisme concurrent)7,8,9. Lorsqu’elle est combinée au séquençage du génome entier, l’évolution expérimentale nous a permis de tester des aspects clés des processus évolutifs, notamment le parallélisme, la répétabilité et la base génomique de l’adaptation. Cependant, à ce jour, la majeure partie de l’évolution expérimentale a été réalisée avec des microbes mésophiles (y compris les bactéries, les champignons et les virus2, 3, 4, 5, mais en grande partie à l’exclusion des archées). Une méthode d’évolution expérimentale applicable aux microbes thermophiles nous permettrait de mieux comprendre comment ils évoluent et contribuerait à une compréhension plus complète de l’évolution. Cela a des implications potentiellement vastes, allant du déchiffrage des origines de la vie thermophile sur Terre aux applications biotechnologiques impliquant des « extrémozymes » utilisés dans les bioprocédés à haute température10 et la recherche astrobiologique11.
L’archéon Sulfolobus acidocaldarius est un candidat idéal comme organisme modèle pour développer des techniques expérimentales d’évolution chez les thermophiles. S. acidocaldarius se reproduit en aérobie, avec une température de croissance optimale à 75 °C (plage de 55 °C à 85 °C) et une acidité élevée (pH 2-3)4,6,12,13,14. Remarquablement, malgré ses conditions de croissance extrêmes, S. acidocaldarius maintient des densités de population et des taux de mutation comparables à ceux des mésophiles 7,15,16,17,18. De plus, il possède un génome relativement petit et bien annoté (souche DSM639 : 2,2 Mb, 36,7 % GC, 2 347 gènes)12 ; S. acidocaldarius bénéficie également d’outils robustes d’ingénierie génomique, permettant une évaluation directe du processus évolutif par le biais d’inactivation ciblée de gènes19. Un exemple notable de cela est la disponibilité de souches génétiquement modifiées de S. acidocaldarius, telles que les souches auxotrophes d’uracile de MW00119 et SK-120, qui peuvent servir de marqueurs sélectionnables.
La conduite d’une évolution expérimentale avec des thermophiles comme S. acidocaldarius présente des défis importants. L’incubation prolongée à haute température requise pour ces études impose une évaporation considérable pour les techniques de culture liquide et solide. Un fonctionnement prolongé à des températures élevées peut également endommager les incubateurs à agitation traditionnels qui sont couramment utilisés dans l’évolution expérimentale des milieux liquides. L’exploration de plusieurs températures nécessite un investissement financier substantiel pour l’acquisition et l’entretien de plusieurs incubateurs. De plus, la forte consommation d’énergie nécessaire soulève d’importantes préoccupations environnementales et financières.
Ce travail présente une méthode pour relever les défis rencontrés lors de la réalisation d’une évolution expérimentale avec des thermophiles comme S. acidocaldarius. S’appuyant sur une technique mise au point par Baes et al. pour étudier la réponse aux chocs thermiques14,21, la méthode développée ici utilise des thermomélangeurs de paillasse pour une incubation à haute température constante et fiable. Son évolutivité permet l’évaluation simultanée de plusieurs traitements thermiques, avec des coûts réduits d’acquisition d’équipements d’incubation supplémentaires. Cela améliore l’efficacité expérimentale, permettant une analyse statistique robuste et une étude approfondie des facteurs influençant la dynamique évolutive chez les thermophiles22. De plus, cette approche réduit considérablement l’investissement financier initial et la consommation d’énergie par rapport aux incubateurs traditionnels, offrant ainsi une alternative plus durable et respectueuse de l’environnement.
Notre méthode jette les bases de l’étude expérimentale de la dynamique évolutive dans des environnements caractérisés par des températures extrêmes, qui peuvent avoir joué un rôle clé au cours des premières étapes de la diversification de la vie sur Terre. Les organismes thermophiles ont des propriétés uniques, mais leurs conditions de croissance extrêmes et leurs exigences spécifiques ont souvent limité leur accessibilité en tant que système modèle. Surmonter ces obstacles élargit non seulement les possibilités de recherche pour étudier la dynamique évolutive, mais renforce également l’utilité plus large des thermophiles en tant que systèmes modèles dans la recherche scientifique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail a permis de développer un protocole d’évolution expérimental pour les thermophiles, ici adapté à l’archéon S. acidocaldarius, mais adaptable à d’autres microbes ayant des besoins de croissance à haute température. Ce protocole s’appuie sur des techniques initialement conçues pour les bactéries mésophiles, mais est spécifiquement modifié pour surmonter les défis techniques associés à la croissance aérobie à haute température<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Prof SV Albers (Université de Fribourg), le Prof Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) et le Dr Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) pour leurs conseils ainsi que la souche S. acidocaldarius DSM639. Ce travail a été financé par une subvention de recherche de la Royal Society (attribuée à DRG : RGS\R1\231308), une subvention de recherche UKRI-NERC « Exploring the Frontiers » (attribuée à DRG et CGK : NE/X012662/1), et une bourse de doctorat de l’Université du Koweït (attribuée à ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
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