Anpassung an den Extremen des Lebens: Experimentelle Evolution mit dem extremophilen Archaeon Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Hier stellen wir ein experimentelles Evolutionsprotokoll zur Anpassung bei Thermophilen vor, bei dem kostengünstige, energieeffiziente Tisch-Thermomischer als Inkubatoren verwendet werden. Die Technik wird durch die Charakterisierung der Temperaturanpassung bei Sulfolobus acidocaldarius, einem Archaeon mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 75 °C, demonstriert.
Abstract
Das Archaeon Sulfolobus acidocaldarius hat sich als vielversprechendes thermophiles Modellsystem herauskristallisiert. Die Untersuchung, wie sich Thermophile an wechselnde Temperaturen anpassen, ist eine wichtige Voraussetzung, nicht nur für das Verständnis grundlegender evolutionärer Prozesse, sondern auch für die Entwicklung von S. acidocaldarius als Chassis für das Bioengineering. Ein großes Hindernis für die Durchführung experimenteller Evolutionsprozesse mit Thermophilen sind die Kosten für die Wartung der Ausrüstung und den Energieverbrauch traditioneller Inkubatoren für das Hochtemperaturwachstum. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird ein umfassendes Versuchsprotokoll für die Durchführung der experimentellen Evolution in S. acidocaldarius vorgestellt, bei dem kostengünstige und energieeffiziente Tisch-Thermomischer zum Einsatz kommen. Das Protokoll beinhaltet eine Batch-Kulturtechnik mit relativ kleinen Volumina (1,5 ml), die die Verfolgung der Adaptation in mehreren unabhängigen Linien ermöglicht. Diese Methode ist durch den Einsatz von zusätzlichen Thermomischern leicht skalierbar. Ein solcher Ansatz erhöht die Zugänglichkeit von S. acidocaldarius als Modellsystem, indem er sowohl die Anfangsinvestitionen als auch die laufenden Kosten für experimentelle Untersuchungen reduziert. Darüber hinaus ist die Technik auf andere mikrobielle Systeme übertragbar, um die Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen zu erforschen.
Introduction
Frühes Leben auf der Erde könnte in extremen Umgebungen entstanden sein, wie z. B. in hydrothermalen Quellen, die durch extrem hohe Temperaturen und Säuregehalt gekennzeichnet sind1. Mikroben bewohnen nach wie vor extreme Umgebungen, darunter heiße Quellen und vulkanische Solfatara. Die Charakterisierung der evolutionären Dynamik, die unter diesen extremen Bedingungen abläuft, könnte Aufschluss über die spezialisierten physiologischen Prozesse geben, die das Überleben unter diesen Bedingungen ermöglichen. Dies kann weitreichende Auswirkungen haben, vom Verständnis der Ursprünge der biologischen Vielfalt bis hin zur Entwicklung neuartiger Hochtemperaturenzyme mit biotechnologischen Anwendungen.
Das Verständnis der mikrobiellen Evolutionsdynamik in extremen Umgebungen ist trotz seiner entscheidenden Bedeutung nach wie vor begrenzt. Im Gegensatz dazu wurde ein bedeutender Wissensschatz über die Evolution in mesophilen Umgebungen durch die Anwendung einer Technik erworben, die als experimentelle Evolution bekannt ist. Die experimentelle Evolution beinhaltet die Beobachtung evolutionärer Veränderungen unter Laborbedingungen 2,3,4,5. Oft handelt es sich dabei um eine definierte Veränderungsumgebung (z. B. Temperatur, Salzgehalt, Einführung eines Toxins oder eines konkurrierenden Organismus)7,8,9. In Kombination mit der Sequenzierung des gesamten Genoms hat uns die experimentelle Evolution ermöglicht, Schlüsselaspekte evolutionärer Prozesse zu testen, einschließlich Parallelität, Wiederholbarkeit und der genomischen Basis für die Anpassung. Bisher wurde jedoch der Großteil der experimentellen Evolution mit mesophilen Mikroben durchgeführt (einschließlich Bakterien, Pilzen und Viren 2,3,4,5, aber weitgehend ohne Archaeen). Eine Methode zur experimentellen Evolution, die auf thermophile Mikroben anwendbar ist, würde es uns ermöglichen, besser zu verstehen, wie sie sich entwickeln, und zu einem umfassenderen Verständnis der Evolution beitragen. Dies hat potenziell weitreichende Auswirkungen, von der Entschlüsselung der Ursprünge des thermophilen Lebens auf der Erde bis hin zu biotechnologischen Anwendungen mit “Extremozyten”, die in Hochtemperatur-Bioprozessen10 und astrobiologischer Forschung11 eingesetzt werden.
Das Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ist ein idealer Kandidat als Modellorganismus für die Entwicklung experimenteller Evolutionstechniken für Thermophile. S. acidocaldarius vermehrt sich aerob mit einer optimalen Wachstumstemperatur bei 75 °C (Bereich 55 °C bis 85 °C) und einem hohen Säuregehalt (pH 2-3)4,6,12,13,14. Bemerkenswert ist, dass S. acidocaldarius trotz seiner extremen Wachstumsbedingungen Populationsdichten und Mutationsraten beibehält, die mit denen von Mesophilenvergleichbar sind 7,15,16,17,18. Darüber hinaus besitzt es ein relativ kleines, gut annotiertes Genom (Stamm DSM639: 2,2 Mb, 36,7 % GC, 2.347 Gene)12; S. acidocaldarius profitiert auch von robusten Genom-Engineering-Werkzeugen, die eine direkte Bewertung des Evolutionsprozesses durch gezielte Gen-Knockouts ermöglichen19. Ein bemerkenswertes Beispiel dafür ist die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen von S. acidocaldarius, wie z. B. die auxotrophen Uracil-Stämme von MW00119 und SK-120, die als selektierbare Marker dienen können.
Es gibt erhebliche Herausforderungen bei der Durchführung experimenteller Evolution mit Thermophilen wie S. acidocaldarius. Eine längere Inkubation bei hohen Temperaturen, die für diese Studien erforderlich ist, erfordert eine erhebliche Verdunstung sowohl für flüssige als auch für feste Kultivierungstechniken. Ein längerer Betrieb bei hohen Temperaturen kann auch die herkömmlichen Schüttelbrutschränke beschädigen, die üblicherweise in der experimentellen Evolution in flüssigen Medien verwendet werden. Die Erforschung mehrerer Temperaturen erfordert eine erhebliche finanzielle Investition für die Anschaffung und Wartung mehrerer Inkubatoren. Darüber hinaus wirft der hohe Energieverbrauch erhebliche ökologische und finanzielle Bedenken auf.
In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, um die Herausforderungen bei der Durchführung experimenteller Evolution mit Thermophilen wie S. acidocaldarius zu bewältigen. Aufbauend auf einer von Baes et al. entwickelten Technik zur Untersuchung der Hitzeschockreaktion14,21 verwendet die hier entwickelte Methode Tisch-Thermomischer für eine konsistente und zuverlässige Hochtemperaturinkubation. Seine Skalierbarkeit ermöglicht die gleichzeitige Bewertung mehrerer Temperaturbehandlungen, wobei die Kosten für die Anschaffung zusätzlicher Inkubationsgeräte reduziert werden. Dies erhöht die experimentelle Effizienz und ermöglicht eine robuste statistische Analyse und eine umfassende Untersuchung von Faktoren, die die Evolutionsdynamik bei Thermophilen beeinflussen22. Darüber hinaus reduziert dieser Ansatz die finanzielle Anfangsinvestition und den Energieverbrauch im Vergleich zu herkömmlichen Inkubatoren erheblich und bietet eine nachhaltigere und umweltfreundlichere Alternative.
Unsere Methode legt den Grundstein für die experimentelle Untersuchung der Evolutionsdynamik in Umgebungen, die durch extreme Temperaturen gekennzeichnet sind und in den frühen Stadien der Diversifizierung des Lebens auf der Erde eine Schlüsselrolle gespielt haben könnten. Thermophile Organismen haben einzigartige Eigenschaften, aber ihre extremen Wachstumsbedingungen und speziellen Anforderungen haben ihre Zugänglichkeit als Modellsystem oft eingeschränkt. Die Überwindung dieser Barrieren erweitert nicht nur die Forschungsmöglichkeiten zur Untersuchung der Evolutionsdynamik, sondern erhöht auch den breiteren Nutzen von Thermophilen als Modellsysteme in der wissenschaftlichen Forschung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wurde ein experimentelles Evolutionsprotokoll für Thermophile entwickelt, das hier auf das Archaeon S. acidocaldarius zugeschnitten ist, aber an andere Mikroben mit hohen Anforderungen an das Wachstum angepasst werden kann. Dieses Protokoll baut auf Techniken auf, die ursprünglich für mesophile Bakterien entwickelt wurden, wurde jedoch speziell modifiziert, um die technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit dem aeroben Wachstum bei hohen Temperaturen zu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Prof. SV Albers (Universität Freiburg), Prof. Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) und Dr. Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) für ihre Beratung sowie dem Stamm S. acidocaldarius DSM639. Diese Arbeit wurde durch ein Royal Society Research Grant (vergeben an DRG: RGS\R1\231308), ein UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” Research Grant (vergeben an DRG und CGK: NE/X012662/1) und ein PhD-Stipendium der Kuwait University (vergeben an ZA) finanziert.
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
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