הסתגלות בקצוות החיים: אבולוציה ניסיונית עם הארכיאון הקיצוני Sulfolobus acidocaldarius
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אבולוציה ניסיוני להסתגלות בתרמופילים המשתמשים בתרמומיקסרים זולים וחסכוניים באנרגיה כאינקובטורים. הטכניקה מודגמת באמצעות אפיון של התאמת טמפרטורה ב Sulfolobus acidocaldarius, ארכיאון עם טמפרטורת צמיחה אופטימלית של 75 ° C.
Abstract
הארכיאון Sulfolobus acidocaldarius התגלה כמערכת מודל תרמופילית מבטיחה. חקירת האופן שבו תרמופילים מסתגלים לטמפרטורות משתנות היא דרישת מפתח, לא רק להבנת תהליכים אבולוציוניים בסיסיים אלא גם לפיתוח S. acidocaldarius כמארז לביו-הנדסה. מכשול עיקרי אחד לביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים הוא הוצאות תחזוקת ציוד ושימוש באנרגיה של אינקובטורים מסורתיים לגידול בטמפרטורה גבוהה. כדי להתמודד עם אתגר זה, מוצג פרוטוקול ניסויי מקיף לביצוע אבולוציה ניסיונית ב- S. acidocaldarius , תוך שימוש בתרמומיקסרים בעלי עלות נמוכה וחסכוניים באנרגיה. הפרוטוקול כולל טכניקת תרבית אצווה עם נפחים קטנים יחסית (1.5 מ”ל), המאפשרת מעקב אחר הסתגלות במספר שושלות עצמאיות. שיטה זו ניתנת להרחבה בקלות באמצעות שימוש בתרמומיקסרים נוספים. גישה כזו מגדילה את הנגישות של S. acidocaldarius כמערכת מודל על ידי הפחתת ההשקעה הראשונית והעלויות המתמשכות הקשורות לחקירות ניסיוניות. יתר על כן, הטכניקה ניתנת להעברה למערכות מיקרוביאליות אחרות לחקר הסתגלות לתנאי סביבה מגוונים.
Introduction
ייתכן שהחיים המוקדמים על פני כדור הארץ מקורם בסביבות קיצוניות, כגון נביעות הידרותרמיות, המאופיינות בטמפרטורות וחומציות גבוהות במיוחד1. מיקרובים ממשיכים לאכלס סביבות קיצוניות, כולל מעיינות חמים וסולפטארה וולקנית. אפיון הדינמיקה האבולוציונית המתרחשת בתנאים קיצוניים אלה עשוי לשפוך אור על התהליכים הפיזיולוגיים המיוחדים המאפשרים הישרדות בתנאים אלה. עשויות להיות לכך השלכות נרחבות, החל מהבנתנו את מקורות המגוון הביולוגי ועד לפיתוח אנזימים חדשים בטמפרטורה גבוהה עם יישומים ביוטכנולוגיים.
ההבנה של דינמיקה אבולוציונית מיקרוביאלית בסביבות קיצוניות נותרה מוגבלת למרות חשיבותה הקריטית. לעומת זאת, גוף ידע משמעותי על אבולוציה בסביבות מזופיליות נרכש באמצעות יישום טכניקה המכונה אבולוציה ניסיונית. אבולוציה ניסויית כוללת התבוננות בשינויים אבולוציוניים בתנאי מעבדה 2,3,4,5. לעתים קרובות, מדובר בסביבת שינוי מוגדרת (למשל, טמפרטורה, מליחות, הכנסת רעלן או אורגניזם מתחרה)7,8,9. בשילוב עם ריצוף גנום שלם, האבולוציה הניסויית אפשרה לנו לבחון היבטים מרכזיים של תהליכים אבולוציוניים, כולל תקבולת, חזרתיות והבסיס הגנומי להסתגלות. עם זאת, עד כה, רוב האבולוציה הניסויית בוצעה עם מיקרובים מזופיליים (כולל חיידקים, פטריות ווירוסים 2,3,4,5, אך במידה רבה לא כולל ארכאה). שיטה לאבולוציה ניסיונית הישימה למיקרובים תרמופיליים תאפשר לנו להבין טוב יותר כיצד הם מתפתחים ותתרום להבנה מקיפה יותר של האבולוציה. יש לכך השלכות פוטנציאליות נרחבות, החל מפענוח מקורות החיים התרמופיליים על פני כדור הארץ וכלה ביישומים ביוטכנולוגיים הכוללים “אקסטרמוזימים” המשמשים בתהליכים ביולוגיים בטמפרטורה גבוהה10 ובמחקר אסטרוביולוגי11.
הארכאון Sulfolobus acidocaldarius הוא מועמד אידיאלי כאורגניזם מודל לפיתוח טכניקות אבולוציה ניסיוניות עבור תרמופילים. S. acidocaldarius מתרבה באופן אירובי, עם טמפרטורת גידול אופטימלית ב 75 ° C (טווח 55 ° C עד 85 ° C) וחומציות גבוהה (pH 2-3) 4,6,12,13,14. למרבה הפלא, למרות תנאי הגידול הקיצוניים שלו, S. acidocaldarius שומר על צפיפות אוכלוסייה ושיעורי מוטציות דומים למזופילים 7,15,16,17,18. בנוסף, הוא בעל גנום קטן יחסית, מבואר היטב (זן DSM639: 2.2 Mb, 36.7% GC, 2,347 גנים)12; S. acidocaldarius נהנה גם מכלים חזקים להנדסת גנום, המאפשרים הערכה ישירה של התהליך האבולוציוני באמצעות נוקאאוטים גנטיים ממוקדים19. דוגמה בולטת לכך היא זמינותם של זנים מהונדסים גנטית של S. acidocaldarius, כגון זנים auxotrophic uracil של MW00119 ו- SK-120, אשר יכולים לשמש סמנים לבחירה.
ישנם אתגרים משמעותיים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. דגירה ממושכת בטמפרטורות גבוהות הנדרשות למחקרים אלה כופה אידוי ניכר הן בטכניקות גידול נוזליות והן בטכניקות גידול מוצקות. פעולה ממושכת בטמפרטורות גבוהות עלולה לפגוע גם באינקובטורים המסורתיים המשמשים בדרך כלל באבולוציה ניסיונית במדיה נוזלית. חקר טמפרטורות מרובות מחייב השקעה כספית משמעותית לרכישה ותחזוקה של מספר חממות. יתר על כן, צריכת האנרגיה הגבוהה הנדרשת מעוררת חששות סביבתיים ופיננסיים משמעותיים.
עבודה זו מציגה שיטה להתמודד עם האתגרים הנתקלים בביצוע אבולוציה ניסיונית עם תרמופילים כמו S. acidocaldarius. בהתבסס על טכניקה שפותחה על ידי Baes et al. לחקר תגובת הלם חום14,21, השיטה שפותחה כאן משתמשת בתרמומיקסרים על ספסל לדגרה עקבית ואמינה בטמפרטורה גבוהה. המדרגיות שלה מאפשרת הערכה בו זמנית של טיפולי טמפרטורה מרובים, עם עלויות מופחתות ברכישת ציוד דגירה נוסף. זה משפר את יעילות הניסוי, ומאפשר ניתוח סטטיסטי חזק וחקירה מקיפה של גורמים המשפיעים על דינמיקה אבולוציונית בתרמופילים22. יתר על כן, גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את ההשקעה הראשונית הפיננסית ואת צריכת האנרגיה בהשוואה לחממות מסורתיות, ומציעה חלופה בת קיימא וידידותית יותר לסביבה.
השיטה שלנו מניחה את היסודות לחקירה ניסויית של דינמיקה אבולוציונית בסביבות המאופיינות בטמפרטורות קיצוניות, שייתכן שמילאו תפקיד מפתח בשלבים המוקדמים של גיוון החיים על פני כדור הארץ. לאורגניזמים תרמופיליים יש תכונות ייחודיות, אך תנאי הגידול הקיצוניים שלהם והדרישות המיוחדות שלהם הגבילו לעתים קרובות את נגישותם כמערכת מודל. התגברות על מחסומים אלה לא רק מרחיבה את הזדמנויות המחקר לחקר דינמיקה אבולוציונית, אלא גם משפרת את התועלת הרחבה יותר של תרמופילים כמערכות מודל במחקר מדעי.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו פיתחה פרוטוקול אבולוציה ניסיוני עבור תרמופילים, המותאם כאן לארכאון S. acidocaldarius, אך ניתן להתאמה למיקרובים אחרים עם דרישות גידול בטמפרטורה גבוהה. פרוטוקול זה מתבסס על טכניקות שתוכננו בתחילה עבור חיידקים מזופיליים, אך שונה במיוחד כדי להתגבר על האתגרים הטכניים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לפרופ’ SV Albers (אוניברסיטת פרייבורג), פרופ’ אוולין פיטרס (Vrije Universiteit Brussel) וד”ר רני באס (Vrije Universiteit Brussel) על הייעוץ ועל הזן S. acidocaldarius DSM639. עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר של החברה המלכותית (הוענק ל- DRG: RGS\R1\231308), מענק מחקר UKRI-NERC “לחקור את הגבולות” (הוענק ל- DRG ו- CGK: NE/X012662/1), ומלגת דוקטורט של אוניברסיטת כווית (שהוענקה ל- ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
References
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
- McDonald, M. J. Microbial experimental evolution – a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992 (2019).
- Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
- McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
- Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
- Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
- Peeters, E., Thia-Toong, T. -. L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
- Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -. V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus – A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474 (2017).
- Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
- Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
- Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532 (2021).
- Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
- Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
- Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605 (2015).
- Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520 (2009).
- Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
- Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214 (2012).
- Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
- Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322 (2023).
- González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
- Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- . Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master’s Thesis Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018)
- Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
- Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8 (2018).
- Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791 (2017).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
