Adattamento agli estremi della vita: evoluzione sperimentale con l'estremofilo Archaeon Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di evoluzione sperimentale per l’adattamento nei termofili che utilizzano termomiscelatori da banco a basso costo ed efficienti dal punto di vista energetico come incubatori. La tecnica è dimostrata attraverso la caratterizzazione dell’adattamento alla temperatura in Sulfolobus acidocaldarius, un archeone con una temperatura di crescita ottimale di 75 °C.
Abstract
L’archaeon Sulfolobus acidocaldarius è emerso come un promettente sistema modello termofilo. Studiare come i termofili si adattano alle variazioni di temperatura è un requisito chiave, non solo per comprendere i processi evolutivi fondamentali, ma anche per sviluppare S. acidocaldarius come telaio per la bioingegneria. Uno dei principali ostacoli alla conduzione dell’evoluzione sperimentale con i termofili è il costo della manutenzione delle apparecchiature e del consumo energetico degli incubatori tradizionali per la crescita ad alta temperatura. Per affrontare questa sfida, viene presentato un protocollo sperimentale completo per condurre l’evoluzione sperimentale in S. acidocaldarius , utilizzando termomiscelatori da banco a basso costo ed efficienti dal punto di vista energetico. Il protocollo prevede una tecnica di coltura batch con volumi relativamente piccoli (1,5 mL), che consente il monitoraggio dell’adattamento in più linee indipendenti. Questo metodo è facilmente scalabile attraverso l’uso di termomiscelatori aggiuntivi. Tale approccio aumenta l’accessibilità di S. acidocaldarius come sistema modello, riducendo sia l’investimento iniziale che i costi correnti associati alle indagini sperimentali. Inoltre, la tecnica è trasferibile ad altri sistemi microbici per esplorare l’adattamento a diverse condizioni ambientali.
Introduction
La vita primordiale sulla Terra potrebbe aver avuto origine in ambienti estremi, come le bocche idrotermali, che sono caratterizzate da temperature e acidità estremamenteelevate. I microbi continuano ad abitare ambienti estremi, tra cui le sorgenti termali e la solfatara vulcanica. Caratterizzare le dinamiche evolutive che si verificano in queste condizioni estreme può far luce sui processi fisiologici specializzati che consentono la sopravvivenza in queste condizioni. Ciò potrebbe avere implicazioni di vasta portata, dalla nostra comprensione delle origini della diversità biologica allo sviluppo di nuovi enzimi ad alta temperatura con applicazioni biotecnologiche.
La comprensione delle dinamiche evolutive microbiche in ambienti estremi rimane limitata nonostante la sua importanza critica. Al contrario, un significativo corpus di conoscenze sull’evoluzione negli ambienti mesofili è stato acquisito attraverso l’applicazione di una tecnica nota come evoluzione sperimentale. L’evoluzione sperimentale comporta l’osservazione del cambiamento evolutivo in condizioni di laboratorio 2,3,4,5. Spesso, ciò comporta un ambiente di cambiamento definito (ad esempio, temperatura, salinità, introduzione di una tossina o di un organismo concorrente)7,8,9. Se combinata con il sequenziamento dell’intero genoma, l’evoluzione sperimentale ci ha permesso di testare aspetti chiave dei processi evolutivi, tra cui il parallelismo, la ripetibilità e le basi genomiche per l’adattamento. Tuttavia, fino ad oggi, la maggior parte dell’evoluzione sperimentale è stata eseguita con microbi mesofili (inclusi batteri, funghi e virus 2,3,4,5, ma in gran parte escludendo gli archei). Un metodo per l’evoluzione sperimentale applicabile ai microbi termofili ci permetterebbe di capire meglio come si evolvono e contribuirebbe a una comprensione più completa dell’evoluzione. Ciò ha implicazioni potenzialmente di vasta portata, dalla decifrazione delle origini della vita termofila sulla Terra alle applicazioni biotecnologiche che coinvolgono gli “estremozimi” utilizzati nei bioprocessi ad alta temperatura10 e nella ricerca astrobiologica11.
L’archaeon Sulfolobus acidocaldarius è un candidato ideale come organismo modello per lo sviluppo di tecniche di evoluzione sperimentale per i termofili. S. acidocaldarius si riproduce aerobicamente, con una temperatura di crescita ottimale a 75 °C (intervallo da 55 °C a 85 °C) e un’elevata acidità (pH 2-3)4,6,12,13,14. Sorprendentemente, nonostante le sue condizioni di crescita estreme, S. acidocaldarius mantiene densità di popolazione e tassi di mutazione paragonabili ai mesofili 7,15,16,17,18. Inoltre, possiede un genoma relativamente piccolo e ben annotato (ceppo DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 geni)12; S. acidocaldarius beneficia anche di robusti strumenti di ingegneria genomica, che consentono una valutazione diretta del processo evolutivo attraverso knockout genici mirati19. Un esempio notevole di ciò è la disponibilità di ceppi geneticamente modificati di S. acidocaldarius, come i ceppi auxotrofici di uracile di MW00119 e SK-120, che possono fungere da marcatori selezionabili.
Ci sono sfide significative nel condurre l’evoluzione sperimentale con termofili come S. acidocaldarius. L’incubazione prolungata ad alte temperature richiesta per questi studi impone una notevole evaporazione sia per le tecniche di coltura liquide che solide. Il funzionamento prolungato ad alte temperature può anche danneggiare i tradizionali incubatori a scuotimento che sono comunemente utilizzati nell’evoluzione sperimentale in mezzi liquidi. L’esplorazione di più temperature richiede un notevole investimento finanziario per l’acquisizione e la manutenzione di diversi incubatori. Inoltre, l’elevato consumo di energia richiesto solleva notevoli preoccupazioni ambientali e finanziarie.
Questo lavoro introduce un metodo per affrontare le sfide incontrate nell’esecuzione dell’evoluzione sperimentale con termofili come S. acidocaldarius. Basandosi su una tecnica sviluppata da Baes et al. per studiare la risposta allo shock termico14,21, il metodo qui sviluppato utilizza termomiscelatori da banco per un’incubazione costante e affidabile ad alta temperatura. La sua scalabilità consente la valutazione simultanea di più trattamenti a temperatura, con costi ridotti per l’acquisizione di ulteriori apparecchiature di incubazione. Ciò migliora l’efficienza sperimentale, consentendo una solida analisi statistica e un’indagine approfondita dei fattori che influenzano le dinamiche evolutive nei termofili22. Inoltre, questo approccio riduce significativamente l’investimento finanziario iniziale e il consumo di energia rispetto agli incubatori tradizionali, offrendo un’alternativa più sostenibile e rispettosa dell’ambiente.
Il nostro metodo pone le basi per lo studio sperimentale delle dinamiche evolutive in ambienti caratterizzati da temperature estreme, che potrebbero aver svolto un ruolo chiave durante le prime fasi della diversificazione della vita sulla Terra. Gli organismi termofili hanno proprietà uniche, ma le loro condizioni di crescita estreme e i requisiti specializzati hanno spesso limitato la loro accessibilità come sistema modello. Il superamento di queste barriere non solo amplia le opportunità di ricerca per lo studio delle dinamiche evolutive, ma migliora anche la più ampia utilità dei termofili come sistemi modello nella ricerca scientifica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro ha sviluppato un protocollo di evoluzione sperimentale per i termofili, qui adattato per l’archaeon S. acidocaldarius, ma adattabile ad altri microbi con esigenze di crescita ad alta temperatura. Questo protocollo si basa su tecniche inizialmente progettate per i batteri mesofili, ma è specificamente modificato per superare le sfide tecniche associate alla crescita aerobica ad alta temperatura 2,4,5,24.<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Prof. SV Albers (Università di Friburgo), la Prof.ssa Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) e la Dott.ssa Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) per i consigli e il ceppo S. acidocaldarius DSM639. Questo lavoro è stato finanziato da una Royal Society Research Grant (assegnata a DRG: RGS\R1\231308), da una borsa di ricerca UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” (assegnata a DRG e CGK: NE/X012662/1) e da una borsa di dottorato dell’Università del Kuwait (assegnata a ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
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