生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化
Summary
ここでは、低コストでエネルギー効率の高いベンチトップサーモミキサーをインキュベーターとして利用し、好熱菌に適応するための実験的進化プロトコルを紹介します。この技術は、最適な成長温度が75°Cの古細菌である Sulfolobus acidocaldariusの温度適応の特性評価を通じて実証されています。
Abstract
古細菌 Sulfolobus acidocaldarius は、有望な好熱性モデルシステムとして浮上しています。好熱菌が温度変化にどのように適応するかを調べることは、基本的な進化過程を理解するためだけでなく、バイオエンジニアリングのシャーシとして S.acidocaldarius を開発するための重要な要件です。好熱菌を用いた実験的進化を行う上での大きな障害の1つは、機器のメンテナンス費用と、従来の高温成長のためのインキュベーターのエネルギー使用です。この課題に対処するために、低コストでエネルギー効率の高いベンチトップサーモミキサーを利用して、 S. acidocaldarius の実験進化を実施するための包括的な実験プロトコルが提示されます。このプロトコールには、比較的少量(1.5 mL)のバッチ培養技術が含まれており、複数の独立した系統での適応の追跡が可能です。この方法は、追加のサーモミキサーを使用することで簡単に拡張できます。このようなアプローチは、初期投資と実験的研究に関連する継続的なコストの両方を削減することにより、モデルシステムとしての S.acidocaldarius のアクセシビリティを高めます。さらに、この技術は、多様な環境条件への適応を探求するために、他の微生物システムにも応用できます。
Introduction
地球上の初期の生命は、非常に高い温度と酸性度を特徴とする熱水噴出孔などの極限環境で生まれた可能性があります1。微生物は、温泉や火山性ソルファタラなどの極限環境に生息し続けています。これらの極限条件下で発生する進化のダイナミクスを特徴づけることは、これらの条件下での生存を可能にする特殊な生理学的プロセスに光を当てるかもしれません。これは、生物多様性の起源の理解から、バイオテクノロジーへの応用による新しい高温酵素の開発まで、幅広い意味を持つ可能性があります。
極限環境における微生物の進化動態の理解は、その決定的な重要性にもかかわらず、まだ限られています。対照的に、中温性環境における進化に関する重要な知識は、実験的進化として知られる技術の適用を通じて獲得されました。実験的進化は、実験室条件下で進化的変化を観察することを含む2,3,4,5。多くの場合、これには定義された変化環境(例えば、温度、塩分、毒素または競合生物の導入)が含まれます7,8,9。全ゲノムシーケンシングと組み合わせることで、実験的進化により、並列性、再現性、適応のためのゲノム基盤など、進化プロセスの主要な側面をテストすることができました。しかし、今日まで、実験的進化の大部分は中温微生物(細菌、真菌、ウイルス2,3,4,5を含むが、古細菌は大部分を除く)で行われてきました。好熱性微生物に適用可能な実験的進化の方法により、微生物がどのように進化するかをよりよく理解し、進化のより包括的な理解に貢献することができます。これは、地球上の好熱性生命の起源の解読から、高温バイオプロセス10や宇宙生物学研究11で使用される「極限性」を含むバイオテクノロジーへの応用まで、潜在的に幅広い意味合いを持っています。
古細菌Sulfolobus acidocaldariusは、好熱菌の実験的進化技術を開発するためのモデル生物として理想的な候補です。S. acidocaldariusは好気的に繁殖し、最適な生育温度は75°C(55°Cから85°Cの範囲)で、酸性度は高い(pH 2-3)4,6,12,13,14です。驚くべきことに、その極端な成長条件にもかかわらず、S. acidocaldariusは中葉7,15,16,17,18に匹敵する個体密度と突然変異率を維持しています。さらに、比較的小さく、十分に注釈されたゲノム(DSM639株:2.2 Mb、36.7%GC、2,347遺伝子)12;S. acidocaldariusはまた、堅牢なゲノムエンジニアリングツールの恩恵を受けており、標的遺伝子ノックアウトを通じて進化過程を直接評価することができる19。この顕著な例は、MW00119 および SK-120 のウラシル補助栄養株など、S. acidocaldarius の遺伝子組み換え株の利用可能性であり、これらは選択可能なマーカーとして機能することができます。
S. acidocaldariusのような好熱菌を用いた実験的進化には大きな課題があります。これらの研究に必要な高温での長時間のインキュベーションは、液体と固体の両方の培養技術にかなりの蒸発を課します。高温での長時間の運転は、液体媒体の実験的進化で一般的に使用される従来の振とうインキュベーターを損傷する可能性もあります。複数の温度を探索するには、複数のインキュベーターを取得して維持するための多額の財政投資が必要です。さらに、必要なエネルギー消費量が多いため、環境面および財政面で大きな懸念が生じています。
この研究では、S. acidocaldariusのような好熱菌で実験的進化を行う際に遭遇する課題に対処する方法を紹介します。Baesらが熱ショック応答を調査するために開発した技術14,21に基づいて、ここで開発された方法は、ベンチトップサーモミキサーを利用して、一貫した信頼性の高い高温インキュベーションを実現します。その拡張性により、複数の温度処理を同時に評価することができ、追加のインキュベーション装置を購入するコストを削減できます。これにより、実験効率が向上し、好熱菌の進化ダイナミクスに影響を与える要因の堅牢な統計分析と広範な調査が可能になります22。さらに、このアプローチは、従来のインキュベーターと比較して、財務的な初期投資とエネルギー消費を大幅に削減し、より持続可能で環境に優しい代替手段を提供します。
私たちの方法は、地球上の生命の多様化の初期段階で重要な役割を果たした可能性のある極端な温度を特徴とする環境における進化のダイナミクスを実験的に調査するための基礎を築きます。好熱性生物は独自の特性を持っていますが、その極端な成長条件と特殊な要件により、モデルシステムとしてのアクセシビリティが制限されることがよくあります。これらの障壁を克服することは、進化のダイナミクスを調査するための研究機会を拡大するだけでなく、科学研究のモデルシステムとしての好熱菌の幅広い有用性を高めることにもなります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、好熱菌のための実験的進化プロトコルを開発しましたが、ここでは古細菌S.acidocaldarius用に調整されていますが、高温成長を必要とする他の微生物にも適応できます。このプロトコルは、当初は中温性細菌用に設計された技術に基づいていますが、高温好気性成長2,4,5,24…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、S. acidocaldarius DSM639株について、S . acidocaldarius DSM639株について、S. Albers教授(フライブルク大学)、Eveline Peeters教授(ブリュッセル自由大学)、Rani Baes博士(ブリュッセル自由大学)に感謝します。この研究は、Royal Society Research Grant(DRG:RGS\R1\231308)、UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” Research Grant(DRGおよびCGK:NE/X012662/1に授与)、およびクウェート大学の博士課程奨学金(ZAに授与)によって資金提供されました。
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
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