여기에서는 저비용의 에너지 효율적인 벤치탑 열혼합기를 인큐베이터로 활용하는 호열성의 적응을 위한 실험적 진화 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 최적 성장 온도가 75 °C인 고세균인 Sulfolobus acidocaldarius의 온도 적응 특성화를 통해 입증되었습니다.
고세균 Sulfolobus acidocaldarius 는 유망한 호열성 모델 시스템으로 부상했습니다. 호열식물이 온도 변화에 어떻게 적응하는지 조사하는 것은 기본적인 진화 과정을 이해하는 것뿐만 아니라 S. acidocaldarius 를 생명공학의 섀시로 개발하기 위한 핵심 요구 사항입니다. 호열성으로 실험적 진화를 수행하는 데 있어 주요 장애물 중 하나는 고온 성장을 위한 기존 인큐베이터의 장비 유지 관리 및 에너지 사용 비용입니다. 이 문제를 해결하기 위해 저비용 및 에너지 효율적인 벤치탑 열혼합기를 사용하여 S. acidocaldarius 에서 실험 진화를 수행하기 위한 포괄적인 실험 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜에는 상대적으로 적은 부피(1.5mL)의 배치 배양 기술이 포함되어 있어 여러 독립적인 계통에서 적응을 추적할 수 있습니다. 이 방법은 추가 열혼합기를 사용하여 쉽게 확장할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 실험 조사와 관련된 초기 투자 및 지속적인 비용을 모두 줄임으로써 모델 시스템으로서 S. acidocaldarius 의 접근성을 높입니다. 또한, 이 기술은 다양한 환경 조건에 대한 적응을 탐구하기 위해 다른 미생물 시스템으로 이전할 수 있습니다.
지구상의 초기 생명체는 극도로 높은 온도와 산성도를 특징으로 하는 열수 분출구와 같은 극한 환경에서 기원했을 수 있다1. 미생물은 온천과 화산 솔파타라를 포함한 극한 환경에서 계속 서식하고 있습니다. 이러한 극한 조건에서 발생하는 진화 역학을 특성화하는 것은 이러한 조건에서 생존을 가능하게 하는 특수한 생리학적 과정에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다. 이는 생물 다양성의 기원에 대한 이해부터 생명공학적 응용을 위한 새로운 고온 효소 개발에 이르기까지 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.
극한 환경에서의 미생물 진화 역학에 대한 이해는 그 중요한 중요성에도 불구하고 제한적인 상태로 남아 있습니다. 대조적으로, 중온성 환경에서의 진화에 대한 중요한 지식은 실험적 진화로 알려진 기술의 적용을 통해 획득되었습니다. 실험적 진화는 실험실 조건 2,3,4,5 하에서 진화적 변화를 관찰하는 것을 포함한다. 종종 여기에는 정의된 변화 환경(예: 온도, 염도, 독소 또는 경쟁 유기체의 도입)이 포함됩니다7,8,9. 전체 게놈 염기서열 분석(whole-genome sequencing)과 결합했을 때, 실험적 진화는 평행성(parallelism), 반복성(repeatability), 적응을 위한 게놈 기반(genomic basis)을 포함한 진화 과정의 주요 측면을 테스트할 수 있게 해주었다. 그러나 현재까지 대부분의 실험적 진화는 중엽성 미생물(박테리아, 곰팡이 및 바이러스 2,3,4,5를 포함하지만 대부분 고세균은 제외)에 대해 수행되었습니다. 호열성 미생물에 적용할 수 있는 실험적 진화 방법은 그들이 어떻게 진화하는지 더 잘 이해할 수 있게 해주고 진화에 대한 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있게 해줄 것입니다. 이는 지구상의 호열성 생명체의 기원을 해독하는 것에서부터 고온 생물과정(hyper-temperature bioprocesses)10 및 우주생물학 연구(astrobiological research)11에 사용되는 ‘극한(extremozymes)’과 관련된 생명공학적 응용에 이르기까지 잠재적으로 광범위한 영향을 미칠 수 있다.
고세균 Sulfolobus acidocaldarius는 호열성을 위한 실험적 진화 기술을 개발하기 위한 모델 유기체로서 이상적인 후보입니다. S. acidocaldarius는 75 °C (55 °C에서 85 °C 범위)의 최적 성장 온도와 높은 산도 (pH 2-3) 4,6,12,13,14로 호기성으로 번식합니다. 놀랍게도, 극한의 성장 조건에도 불구하고 S. acidocaldarius는 중엽체 7,15,16,17,18에 필적하는 개체군 밀도와 돌연변이 비율을 유지합니다. 또한 상대적으로 작고 주석이 잘 달린 게놈을 가지고 있습니다(DSM639 균주: 2.2Mb, 36.7% GC, 2,347개 유전자)12; S. acidocaldarius는 또한 강력한 게놈 엔지니어링 도구의 이점을 활용하여 표적 유전자 knockout을 통해 진화 과정을 직접 평가할 수 있습니다19. 이에 대한 주목할 만한 예는 선택 가능한 마커 역할을 할 수 있는 MW00119 및 SK-120의 우라실 보조영양 균주와 같은 S. acidocaldarius의 유전자 변형 균주의 가용성입니다.
S. acidocaldarius와 같은 호열성으로 실험적 진화를 수행하는 데는 상당한 어려움이 있습니다. 이러한 연구에 필요한 고온에서 장시간 배양은 액체 및 고체 배양 기술 모두에 상당한 증발을 부과합니다. 고온에서 장시간 작동하면 액체 매체의 실험적 진화에 일반적으로 사용되는 기존의 진탕 인큐베이터가 손상될 수도 있습니다. 여러 온도를 탐사하려면 여러 인큐베이터를 구입하고 유지하기 위해 상당한 재정적 투자가 필요합니다. 또한 높은 에너지 소비가 필요하기 때문에 심각한 환경 및 재정적 우려가 제기됩니다.
이 연구는 S. acidocaldarius와 같은 호열성으로 실험적 진화를 수행할 때 직면하는 문제를 해결하는 방법을 소개합니다. 열 충격 반응14,21을 조사하기 위해 Baes et al.이 개발한 기술을 기반으로 여기에서 개발된 방법은 일관되고 신뢰할 수 있는 고온 배양을 위해 벤치탑 열혼합기를 사용합니다. 확장성을 통해 여러 온도 처리를 동시에 평가할 수 있으며 추가 배양 장비를 구입하는 데 드는 비용을 절감할 수 있습니다. 이는 실험의 효율성을 향상시켜 강력한 통계 분석과 호열성에서 진화 역학에 영향을 미치는 요인에 대한 광범위한 조사를 가능하게 합니다22. 또한 이 접근 방식은 기존 인큐베이터에 비해 재정적 초기 투자 및 에너지 소비를 크게 줄여 보다 지속 가능하고 환경 친화적인 대안을 제공합니다.
우리의 방법은 지구상의 생명체 다양화의 초기 단계에서 중요한 역할을 했을 수 있는 극한의 온도로 특징지어지는 환경에서 진화 역학을 실험적으로 조사하기 위한 토대를 마련합니다. 호열성 유기체는 고유한 특성을 가지고 있지만 극한의 성장 조건과 특수한 요구 사항으로 인해 모델 시스템으로서의 접근성이 제한되는 경우가 많습니다. 이러한 장벽을 극복하면 진화 역학을 조사하기 위한 연구 기회가 확장될 뿐만 아니라 과학 연구에서 모델 시스템으로서 호열성의 광범위한 유용성이 향상됩니다.
이 연구는 호열성을 위한 실험적 진화 프로토콜을 개발했으며, 여기서는 고세균 S. acidocaldarius에 맞게 조정되었지만 고온 성장 요구 사항이 있는 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기에 중온성 박테리아를 위해 설계된 기술을 기반으로 하지만 고온 호기성 성장 2,4,5,24</s…
The authors have nothing to disclose.
저자들은 SV Albers 교수(프라이부르크 대학교), Eveline Peeters 교수(Vrije Universiteit Brussel) 및 Rani Baes 박사(Vrije Universiteit Brussel)에게 조언과 S. acidocaldarius DSM639 균주에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 왕립 학회 연구 보조금(DRG에 수여: RGS\R1\231308), UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” 연구 보조금(DRG 및 CGK에 수여: NE/X012662/1) 및 쿠웨이트 대학교 박사 장학금(ZA에 수여)의 지원을 받았습니다.
0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
Double-distilled water (ddH2O) | |||
Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |