Tilpasning i livets ytterpunkter: Eksperimentell evolusjon med den ekstremofile arkeonen Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Her presenterer vi en eksperimentell evolusjonsprotokoll for tilpasning i termofiler ved bruk av rimelige, energieffektive stasjonære termomiksere som inkubatorer. Teknikken er demonstrert gjennom karakterisering av temperaturtilpasning i Sulfolobus acidocaldarius, en arkeon med en optimal veksttemperatur på 75 °C.
Abstract
Arkeonen Sulfolobus acidocaldarius har dukket opp som et lovende termofilt modellsystem. Å undersøke hvordan termofiler tilpasser seg skiftende temperaturer er et sentralt krav, ikke bare for å forstå grunnleggende evolusjonære prosesser, men også for å utvikle S. acidocaldarius som et chassis for bioteknologi. En stor hindring for å utføre eksperimentell evolusjon med termofile er utgiftene til vedlikehold av utstyr og energibruk av tradisjonelle inkubatorer for høytemperaturvekst. For å møte denne utfordringen presenteres en omfattende eksperimentell protokoll for å utføre eksperimentell evolusjon i S. acidocaldarius , ved bruk av rimelige og energieffektive stasjonære termomiksere. Protokollen involverer en batchkulturteknikk med relativt små volumer (1,5 ml), som muliggjør sporing av tilpasning i flere uavhengige avstamninger. Denne metoden er lett skalerbar ved bruk av ekstra termomiksere. En slik tilnærming øker tilgjengeligheten til S. acidocaldarius som modellsystem ved å redusere både startinvesteringer og løpende kostnader knyttet til eksperimentelle undersøkelser. Videre er teknikken overførbar til andre mikrobielle systemer for å utforske tilpasning til ulike miljøforhold.
Introduction
Tidlig liv på jorden kan ha sin opprinnelse i ekstreme miljøer, for eksempel hydrotermale ventiler, som er preget av ekstremt høye temperaturer og surhet1. Mikrober fortsetter å bo i ekstreme miljøer, inkludert varme kilder og vulkansk solfatara. Karakterisering av den evolusjonære dynamikken som oppstår under disse ekstreme forholdene kan kaste lys over de spesialiserte fysiologiske prosessene som muliggjør overlevelse under disse forholdene. Dette kan ha vidtrekkende implikasjoner, fra vår forståelse av opprinnelsen til biologisk mangfold til utviklingen av nye høytemperaturenzymer med bioteknologiske anvendelser.
Forståelsen av mikrobiell evolusjonær dynamikk i ekstreme miljøer er fortsatt begrenset til tross for dens kritiske betydning. Derimot har en betydelig mengde kunnskap om evolusjon i mesofile miljøer blitt tilegnet gjennom bruk av en teknikk kjent som eksperimentell evolusjon. Eksperimentell evolusjon innebærer å observere evolusjonær endring under laboratorieforhold 2,3,4,5. Ofte involverer dette et definert endringsmiljø (f.eks. temperatur, saltholdighet, introduksjon av et toksin eller en konkurrerende organisme)7,8,9. Når det kombineres med helgenomsekvensering, har eksperimentell evolusjon gjort det mulig for oss å teste viktige aspekter ved evolusjonære prosesser, inkludert parallellitet, repeterbarhet og det genomiske grunnlaget for tilpasning. Til dags dato har imidlertid mesteparten av eksperimentell evolusjon blitt utført med mesofile mikrober (inkludert bakterier, sopp og virus 2,3,4,5, men stort sett ekskludert archaea). En metode for eksperimentell evolusjon som kan brukes på termofile mikrober vil gjøre oss i stand til bedre å forstå hvordan de utvikler seg og bidra til en mer omfattende forståelse av evolusjon. Dette har potensielt vidtrekkende implikasjoner, fra å tyde opprinnelsen til termofilt liv på jorden til bioteknologiske applikasjoner som involverer “ekstremozymer” brukt i høytemperaturbioprosesser10 og astrobiologisk forskning11.
Arkeonen Sulfolobus acidocaldarius er en ideell kandidat som modellorganisme for å utvikle eksperimentelle evolusjonsteknikker for termofile. S. acidocaldarius reproduserer aerobt, med en optimal veksttemperatur ved 75 °C (område 55 °C til 85 °C) og høy surhet (pH 2-3)4,6,12,13,14. Bemerkelsesverdig nok, til tross for sine ekstreme vekstforhold, opprettholder S. acidocaldarius populasjonstettheter og mutasjonsrater som kan sammenlignes med mesofile 7,15,16,17,18. I tillegg har den et relativt lite, godt kommentert genom (stamme DSM639: 2,2 Mb, 36,7 % GC, 2 347 gener)12; S. acidocaldarius drar også nytte av robuste genomtekniske verktøy, noe som muliggjør en direkte vurdering av evolusjonsprosessen gjennom målrettede genknockouts19. Et bemerkelsesverdig eksempel på dette er tilgjengeligheten av genmodifiserte stammer av S. acidocaldarius, slik som de uracil auxotrofiske stammene av MW00119 og SK-120, som kan tjene som valgbare markører.
Det er betydelige utfordringer med å utføre eksperimentell evolusjon med termofiler som S. acidocaldarius. Utvidet inkubasjon ved høye temperaturer som kreves for disse studiene pålegger betydelig fordampning for både flytende og faste dyrkingsteknikker. Langvarig drift ved høye temperaturer kan også skade de tradisjonelle risteinkubatorene som ofte brukes i eksperimentell evolusjon i flytende medier. Å utforske flere temperaturer krever en betydelig økonomisk investering for å anskaffe og vedlikeholde flere inkubatorer. Videre reiser det høye energiforbruket betydelige miljømessige og økonomiske bekymringer.
Dette arbeidet introduserer en metode for å løse utfordringene som oppstår ved å utføre eksperimentell evolusjon med termofiler som S. acidocaldarius. Metoden utviklet her bygger på en teknikk utviklet av Baes et al. for å undersøke varmesjokkrespons14,21, og bruker stasjonære termomiksere for konsistent og pålitelig høytemperaturinkubasjon. Skalerbarheten gjør det mulig å vurdere flere temperaturbehandlinger samtidig, med reduserte kostnader ved anskaffelse av ekstra inkubasjonsutstyr. Dette forbedrer eksperimentell effektivitet, muliggjør robust statistisk analyse og omfattende undersøkelse av faktorer som påvirker evolusjonær dynamikk i termofile22. Dessuten reduserer denne tilnærmingen den økonomiske startinvesteringen og energiforbruket betydelig sammenlignet med tradisjonelle inkubatorer, og tilbyr et mer bærekraftig og miljøvennlig alternativ.
Metoden vår legger grunnlaget for eksperimentelt å undersøke evolusjonær dynamikk i miljøer preget av ekstreme temperaturer, som kan ha spilt en nøkkelrolle i de tidlige stadiene av diversifiseringen av livet på jorden. Termofile organismer har unike egenskaper, men deres ekstreme vekstforhold og spesialiserte krav har ofte begrenset deres tilgjengelighet som modellsystem. Å overvinne disse barrierene utvider ikke bare forskningsmulighetene for å undersøke evolusjonær dynamikk, men forbedrer også den bredere nytten av termofiler som modellsystemer i vitenskapelig forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbeidet har utviklet en eksperimentell evolusjonsprotokoll for termofiler, her skreddersydd for arkeonen S. acidocaldarius, men som kan tilpasses andre mikrober med høye temperaturvekstkrav. Denne protokollen bygger på teknikker som opprinnelig ble designet for mesofile bakterier, men er spesielt modifisert for å overvinne de tekniske utfordringene knyttet til aerob vekst ved høy temperatur 2,4,5,24.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Prof SV Albers (Universitetet i Freiburg), Prof Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) og Dr Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) for råd og S. acidocaldarius DSM639-stammen. Dette arbeidet ble finansiert av et Royal Society Research Grant (tildelt DRG: RGS\R1\231308), et UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” Research Grant (tildelt DRG og CGK: NE/X012662/1), og et Kuwait University PhD-stipend (tildelt ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
References
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
- McDonald, M. J. Microbial experimental evolution – a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992 (2019).
- Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
- McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
- Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
- Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
- Peeters, E., Thia-Toong, T. -. L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
- Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -. V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus – A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474 (2017).
- Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
- Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
- Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532 (2021).
- Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
- Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
- Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605 (2015).
- Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520 (2009).
- Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
- Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214 (2012).
- Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
- Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322 (2023).
- González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
- Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- . Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master’s Thesis Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018)
- Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
- Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8 (2018).
- Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791 (2017).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
