Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de evolução experimental para adaptação em termófilos utilizando termomisturadores de bancada de baixo custo e eficiência energética como incubadoras. A técnica é demonstrada através da caracterização da adaptação à temperatura em Sulfolobus acidocaldarius, um archaeon com temperatura ótima de crescimento de 75 °C.
Abstract
O archaeon Sulfolobus acidocaldarius emergiu como um promissor sistema modelo termofílico. Investigar como os termófilos se adaptam às mudanças de temperatura é um requisito fundamental, não apenas para entender os processos evolutivos fundamentais, mas também para desenvolver S. acidocaldarius como um chassi para a bioengenharia. Um grande obstáculo para a realização da evolução experimental com termófilos é o custo de manutenção de equipamentos e uso de energia de incubadoras tradicionais para crescimento em altas temperaturas. Para enfrentar esse desafio, é apresentado um protocolo experimental abrangente para a realização de evolução experimental em S. acidocaldarius , utilizando termomisturadores de bancada de baixo custo e eficiência energética. O protocolo envolve uma técnica de cultura em batelada com volumes relativamente pequenos (1,5 mL), permitindo o rastreamento da adaptação em múltiplas linhagens independentes. Este método é facilmente escalável através do uso de termomisturadores adicionais. Tal abordagem aumenta a acessibilidade de S. acidocaldarius como um sistema modelo, reduzindo o investimento inicial e os custos contínuos associados às investigações experimentais. Além disso, a técnica é transferível para outros sistemas microbianos para explorar a adaptação a diversas condições ambientais.
Introduction
O início da vida na Terra pode ter se originado em ambientes extremos, como fontes hidrotermais, que são caracterizadas por temperaturas e acidez extremamente altas1. Os micróbios continuam a habitar ambientes extremos, incluindo fontes termais e solfatara vulcânica. Caracterizar a dinâmica evolutiva que ocorre sob essas condições extremas pode lançar luz sobre os processos fisiológicos especializados que permitem a sobrevivência nessas condições. Isso pode ter implicações abrangentes, desde nossa compreensão das origens da diversidade biológica até o desenvolvimento de novas enzimas de alta temperatura com aplicações biotecnológicas.
A compreensão da dinâmica evolutiva microbiana em ambientes extremos permanece limitada, apesar de sua importância crítica. Em contraste, um corpo significativo de conhecimento sobre a evolução em ambientes mesófilos foi adquirido através da aplicação de uma técnica conhecida como evolução experimental. A evolução experimental envolve a observação de mudanças evolutivas em condições de laboratório 2,3,4,5. Muitas vezes, isso envolve um ambiente de mudança definido (por exemplo, temperatura, salinidade, introdução de uma toxina ou de um organismo competidor)7,8,9. Quando combinada com o sequenciamento do genoma completo, a evolução experimental nos permitiu testar aspectos-chave dos processos evolutivos, incluindo paralelismo, repetibilidade e a base genômica para adaptação. No entanto, até o momento, a maior parte da evolução experimental foi realizada com micróbios mesófilos (incluindo bactérias, fungos e vírus 2,3,4,5, mas excluindo em grande parte archaea). Um método de evolução experimental aplicável a micróbios termofílicos nos permitiria entender melhor como eles evoluem e contribuir para uma compreensão mais abrangente da evolução. Isso tem implicações potencialmente abrangentes, desde decifrar as origens da vida termofílica na Terra até aplicações biotecnológicas envolvendo ‘extremozimas’ usadas em bioprocessos de alta temperatura10 e pesquisa astrobiológica11.
O archaeon Sulfolobus acidocaldarius é um candidato ideal como organismo modelo para o desenvolvimento de técnicas experimentais de evolução para termófilos. S. acidocaldarius reproduz-se aeróbico, com uma temperatura ótima de crescimento a 75 ° C (faixa de 55 ° C a 85 ° C) e alta acidez (pH 2-3) 4 , 6 , 12 , 13 , 14 . Notavelmente, apesar de suas condições extremas de crescimento, S. acidocaldarius mantém densidades populacionais e taxas de mutação comparáveis aos mesófilos 7,15,16,17,18. Além disso, possui um genoma relativamente pequeno e bem anotado (cepa DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 genes)12; S. acidocaldarius também se beneficia de ferramentas robustas de engenharia genômica, permitindo uma avaliação direta do processo evolutivo por meio de nocautes genéticos direcionados19. Um exemplo notável disso é a disponibilidade de cepas geneticamente modificadas de S. acidocaldarius, como as cepas auxotróficas de uracila de MW00119 e SK-120, que podem servir como marcadores selecionáveis.
Existem desafios significativos na condução da evolução experimental com termófilos como S. acidocaldarius. A incubação prolongada em altas temperaturas necessária para esses estudos impõe uma evaporação considerável para as técnicas de cultura líquida e sólida. A operação prolongada em altas temperaturas também pode danificar as tradicionais incubadoras de agitação que são comumente usadas na evolução experimental em meios líquidos. A exploração de várias temperaturas requer um investimento financeiro substancial para adquirir e manter várias incubadoras. Além disso, o elevado consumo de energia necessário levanta preocupações ambientais e financeiras significativas.
Este trabalho apresenta um método para enfrentar os desafios encontrados na realização de evolução experimental com termófilos como S. acidocaldarius. Com base em uma técnica desenvolvida por Baes et al. para investigar a resposta ao choque térmico14,21, o método desenvolvido aqui utiliza termomisturadores de bancada para incubação consistente e confiável em alta temperatura. Sua escalabilidade permite a avaliação simultânea de múltiplos tratamentos de temperatura, com custos reduzidos na aquisição de equipamentos adicionais de incubação. Isso aumenta a eficiência experimental, permitindo uma análise estatística robusta e uma extensa investigação dos fatores que influenciam a dinâmica evolutiva em termófilos22. Além disso, essa abordagem reduz significativamente o investimento financeiro inicial e o consumo de energia em comparação com as incubadoras tradicionais, oferecendo uma alternativa mais sustentável e ecologicamente correta.
Nosso método estabelece as bases para investigar experimentalmente a dinâmica evolutiva em ambientes caracterizados por temperaturas extremas, que podem ter desempenhado um papel fundamental durante os estágios iniciais da diversificação da vida na Terra. Os organismos termofílicos têm propriedades únicas, mas suas condições extremas de crescimento e requisitos especializados muitas vezes limitam sua acessibilidade como sistema modelo. A superação dessas barreiras não apenas expande as oportunidades de pesquisa para investigar a dinâmica evolutiva, mas também aumenta a utilidade mais ampla dos termófilos como sistemas modelo na pesquisa científica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho desenvolveu um protocolo experimental de evolução para termófilos, aqui adaptado para o archaeon S. acidocaldarius, mas adaptável a outros micróbios com requisitos de crescimento em altas temperaturas. Este protocolo baseia-se em técnicas inicialmente projetadas para bactérias mesófilas, mas é especificamente modificado para superar os desafios técnicos associados ao crescimento aeróbico em alta temperatura<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Prof. SV Albers (Universidade de Freiburg), à Prof. Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) e ao Dr. Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) pelo conselho e à cepa S. acidocaldarius DSM639. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa da Royal Society (concedida ao DRG: RGS \ R1 \ 231308), uma bolsa de pesquisa UKRI-NERC “Exploring the Frontiers” (concedida ao DRG e CGK: NE / X012662 / 1) e uma bolsa de doutorado da Universidade do Kuwait (concedida ao ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
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