Adaptación en los Extremos de la Vida: Evolución Experimental con el Arqueón Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de evolución experimental para la adaptación en termófilos utilizando termomezcladores de sobremesa de bajo costo y eficiencia energética como incubadoras. La técnica se demuestra a través de la caracterización de la adaptación a la temperatura en Sulfolobus acidocaldarius, una arquea con una temperatura óptima de crecimiento de 75 °C.
Abstract
El arqueo Sulfolobus acidocaldarius ha surgido como un prometedor sistema modelo termófilo. Investigar cómo los termófilos se adaptan a los cambios de temperatura es un requisito clave, no solo para comprender los procesos evolutivos fundamentales, sino también para desarrollar S. acidocaldarius como chasis para la bioingeniería. Un obstáculo importante para llevar a cabo la evolución experimental con termófilos es el costo del mantenimiento del equipo y el uso de energía de las incubadoras tradicionales para el crecimiento a alta temperatura. Para abordar este desafío, se presenta un protocolo experimental integral para llevar a cabo la evolución experimental en S. acidocaldarius, utilizando termomezcladores de sobremesa de bajo costo y eficiencia energética. El protocolo implica una técnica de cultivo por lotes con volúmenes relativamente pequeños (1,5 mL), lo que permite el seguimiento de la adaptación en múltiples linajes independientes. Este método es fácilmente escalable mediante el uso de termomezcladores adicionales. Este enfoque aumenta la accesibilidad de S. acidocaldarius como sistema modelo al reducir tanto la inversión inicial como los costos continuos asociados con las investigaciones experimentales. Además, la técnica es transferible a otros sistemas microbianos para explorar la adaptación a diversas condiciones ambientales.
Introduction
La vida primitiva en la Tierra puede haberse originado en ambientes extremos, como los respiraderos hidrotermales, que se caracterizan por temperaturas y acidez extremadamentealtas. Los microbios continúan habitando en ambientes extremos, incluyendo aguas termales y solfatara volcánica. La caracterización de la dinámica evolutiva que ocurre en estas condiciones extremas puede arrojar luz sobre los procesos fisiológicos especializados que permiten la supervivencia en estas condiciones. Esto puede tener implicaciones de gran alcance, desde nuestra comprensión de los orígenes de la diversidad biológica hasta el desarrollo de nuevas enzimas de alta temperatura con aplicaciones biotecnológicas.
La comprensión de la dinámica evolutiva microbiana en entornos extremos sigue siendo limitada a pesar de su importancia crítica. Por el contrario, se ha adquirido un importante cuerpo de conocimientos sobre la evolución en ambientes mesófilos mediante la aplicación de una técnica conocida como evolución experimental. La evolución experimental implica observar el cambio evolutivo en condiciones de laboratorio 2,3,4,5. A menudo, esto implica un entorno de cambio definido (por ejemplo, temperatura, salinidad, introducción de una toxina o un organismo competidor)7,8,9. Cuando se combina con la secuenciación del genoma completo, la evolución experimental nos ha permitido probar aspectos clave de los procesos evolutivos, incluido el paralelismo, la repetibilidad y la base genómica para la adaptación. Sin embargo, hasta la fecha, la mayor parte de la evolución experimental se ha realizado con microbios mesófilos (incluyendo bacterias, hongos y virus 2,3,4,5, pero excluyendo en gran medida las arqueas). Un método de evolución experimental aplicable a los microbios termófilos nos permitiría comprender mejor cómo evolucionan y contribuiría a una comprensión más completa de la evolución. Esto tiene implicaciones potencialmente de gran alcance, desde descifrar los orígenes de la vida termófila en la Tierra hasta aplicaciones biotecnológicas que involucran “extremozimas” utilizadas en bioprocesos de alta temperatura10 e investigación astrobiológica11.
La arquea Sulfolobus acidocaldarius es un candidato ideal como organismo modelo para el desarrollo de técnicas experimentales de evolución para termófilos. S. acidocaldarius se reproduce aeróbicamente, con una temperatura óptima de crecimiento a 75 °C (rango de 55 °C a 85 °C) y alta acidez (pH 2-3)4,6,12,13,14. Sorprendentemente, a pesar de sus condiciones extremas de crecimiento, S. acidocaldarius mantiene densidades de población y tasas de mutación comparables a las de los mesófilos 7,15,16,17,18. Además, posee un genoma relativamente pequeño y bien anotado (cepa DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 genes)12; S. acidocaldarius también se beneficia de sólidas herramientas de ingeniería genómica, que permiten una evaluación directa del proceso evolutivo a través de knockouts de genes específicos19. Un ejemplo notable de esto es la disponibilidad de cepas genéticamente modificadas de S. acidocaldarius, como las cepas auxotróficas de uracilo de MW00119 y SK-120, que pueden servir como marcadores seleccionables.
Existen desafíos significativos con la realización de la evolución experimental con termófilos como S. acidocaldarius. La incubación prolongada a altas temperaturas requerida para estos estudios impone una evaporación considerable para las técnicas de cultivo tanto líquidas como sólidas. El funcionamiento prolongado a altas temperaturas también puede dañar las incubadoras de agitación tradicionales que se utilizan habitualmente en la evolución experimental en medios líquidos. La exploración de múltiples temperaturas requiere una inversión financiera sustancial para adquirir y mantener varias incubadoras. Además, el alto consumo de energía requerido plantea importantes preocupaciones ambientales y financieras.
Este trabajo presenta un método para abordar los desafíos encontrados en la realización de la evolución experimental con termófilos como S. acidocaldarius. Basándose en una técnica desarrollada por Baes et al. para investigar la respuesta al choque térmico14,21, el método desarrollado aquí utiliza termomezcladores de sobremesa para una incubación consistente y confiable a alta temperatura. Su escalabilidad permite la evaluación simultánea de múltiples tratamientos de temperatura, con costos reducidos en la adquisición de equipos de incubación adicionales. Esto mejora la eficiencia experimental, permitiendo un análisis estadístico robusto y una investigación exhaustiva de los factores que influyen en la dinámica evolutiva de los termófilos22. Además, este enfoque reduce significativamente la inversión financiera inicial y el consumo de energía en comparación con las incubadoras tradicionales, ofreciendo una alternativa más sostenible y respetuosa con el medio ambiente.
Nuestro método sienta las bases para investigar experimentalmente la dinámica evolutiva en entornos caracterizados por temperaturas extremas, que pueden haber desempeñado un papel clave durante las primeras etapas de la diversificación de la vida en la Tierra. Los organismos termófilos tienen propiedades únicas, pero sus condiciones extremas de crecimiento y requisitos especializados a menudo han limitado su accesibilidad como sistema modelo. La superación de estas barreras no solo amplía las oportunidades de investigación para investigar la dinámica evolutiva, sino que también mejora la utilidad más amplia de los termófilos como sistemas modelo en la investigación científica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo ha desarrollado un protocolo experimental de evolución para termófilos, aquí adaptado para la arquea S. acidocaldarius, pero adaptable a otros microbios con requisitos de crecimiento a altas temperaturas. Este protocolo se basa en técnicas inicialmente diseñadas para bacterias mesófilas, pero se modifica específicamente para superar los desafíos técnicos asociados con el crecimiento aeróbico a alta temperatura 2,4,5,24.<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Prof. SV Albers (Universidad de Friburgo), a la Prof. Eveline Peeters (Vrije Universiteit Brussel) y a la Dra. Rani Baes (Vrije Universiteit Brussel) por sus consejos y a la cepa S. acidocaldarius DSM639. Este trabajo fue financiado por una beca de investigación de la Royal Society (otorgada a DRG: RGS\R1\231308), una beca de investigación “Exploring the Frontiers” de UKRI-NERC (otorgada a DRG y CGK: NE/X012662/1) y una beca de doctorado de la Universidad de Kuwait (otorgada a ZA).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
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