Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim
Summary
Burada, inkübatör olarak düşük maliyetli, enerji verimli tezgah üstü termomikserler kullanan termofillerde adaptasyon için deneysel bir evrim protokolü sunuyoruz. Teknik, 75 °C’lik optimum büyüme sıcaklığına sahip bir arkeon olan Sulfolobus acidocaldarius’ta sıcaklık adaptasyonunun karakterizasyonu yoluyla gösterilmiştir.
Abstract
Arkeon Sulfolobus acidocaldarius , umut verici bir termofilik model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Termofillerin değişen sıcaklıklara nasıl adapte olduklarını araştırmak, yalnızca temel evrimsel süreçleri anlamak için değil, aynı zamanda S. acidocaldarius’u biyomühendislik için bir şasi olarak geliştirmek için de önemli bir gerekliliktir. Termofillerle deneysel evrim yürütmenin önündeki en büyük engellerden biri, yüksek sıcaklıkta büyüme için geleneksel inkübatörlerin ekipman bakımı ve enerji kullanımı masraflarıdır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, S. acidocaldarius’ta deneysel evrim yürütmek için düşük maliyetli ve enerji açısından verimli tezgah üstü termomikserler kullanan kapsamlı bir deneysel protokol sunulmuştur. Protokol, nispeten küçük hacimli (1.5 mL) bir toplu kültür tekniğini içerir ve birden fazla bağımsız soyda adaptasyonun izlenmesini sağlar. Bu yöntem, ek termomikserler kullanılarak kolayca ölçeklenebilir. Böyle bir yaklaşım, hem ilk yatırımı hem de deneysel araştırmalarla ilişkili devam eden maliyetleri azaltarak S. acidocaldarius’un bir model sistem olarak erişilebilirliğini arttırır. Ayrıca, teknik, çeşitli çevresel koşullara adaptasyonu keşfetmek için diğer mikrobiyal sistemlere aktarılabilir.
Introduction
Dünyadaki erken yaşam, aşırı yüksek sıcaklıklar ve asitlik1 ile karakterize edilen hidrotermal menfezler gibi aşırı ortamlarda ortaya çıkmış olabilir. Mikroplar, kaplıcalar ve volkanik solfatara da dahil olmak üzere aşırı ortamlarda yaşamaya devam ediyor. Bu aşırı koşullar altında meydana gelen evrimsel dinamikleri karakterize etmek, bu koşullar altında hayatta kalmayı sağlayan özel fizyolojik süreçlere ışık tutabilir. Bunun, biyolojik çeşitliliğin kökenlerini anlamamızdan, biyoteknolojik uygulamalarla yeni yüksek sıcaklık enzimlerinin geliştirilmesine kadar geniş kapsamlı etkileri olabilir.
Aşırı ortamlarda mikrobiyal evrimsel dinamiklerin anlaşılması, kritik önemine rağmen sınırlı kalmaktadır. Buna karşılık, mezofilik ortamlarda evrim hakkında önemli bir bilgi birikimi, deneysel evrim olarak bilinen bir tekniğin uygulanmasıyla elde edilmiştir. Deneysel evrim, laboratuvar koşullarıaltında evrimsel değişimi gözlemlemeyi içerir 2,3,4,5. Genellikle bu, tanımlanmış bir değişim ortamını içerir (örneğin, sıcaklık, tuzluluk, bir toksinin veya rakip bir organizmanın eklenmesi)7,8,9. Tüm genom dizilimi ile birleştirildiğinde, deneysel evrim, paralellik, tekrarlanabilirlik ve adaptasyon için genomik temel dahil olmak üzere evrimsel süreçlerin temel yönlerini test etmemizi sağlamıştır. Bununla birlikte, bugüne kadar, deneysel evrimin büyük kısmı mezofilik mikroplarla (bakteriler, mantarlar ve virüsler 2,3,4,5 dahil, ancak büyük ölçüde arkeler hariç) gerçekleştirilmiştir. Termofilik mikroplara uygulanabilen bir deneysel evrim yöntemi, onların nasıl evrimleştiklerini daha iyi anlamamızı sağlayacak ve daha kapsamlı bir evrim anlayışına katkıda bulunacaktır. Bunun, Dünya’daki termofilik yaşamın kökenlerini deşifre etmekten, yüksek sıcaklıktaki biyoproseslerde10 ve astrobiyolojik araştırmalarda11 kullanılan ‘ekstremozimleri’ içeren biyoteknolojik uygulamalara kadar potansiyel olarak geniş kapsamlı etkileri vardır.
Archaeon Sulfolobus acidocaldarius, termofiller için deneysel evrim teknikleri geliştirmek için model organizma olarak ideal bir adaydır. S. acidocaldarius, 75 °C’de (aralık 55 °C ila 85 °C) optimum büyüme sıcaklığı ve yüksek asitlik (pH 2-3) ile aerobik olarak çoğalır4,6,12,13,14. Dikkat çekici bir şekilde, aşırı büyüme koşullarına rağmen, S. acidocaldarius, mezofiller 7,15,16,17,18 ile karşılaştırılabilir popülasyon yoğunluklarını ve mutasyon oranlarını korur. Ek olarak, nispeten küçük, iyi açıklamalı bir genoma sahiptir (DSM639 türü: 2.2 Mb, %36.7 GC, 2.347 gen)12; S. acidocaldarius ayrıca, hedeflenen gen nakavtları yoluyla evrimsel sürecin doğrudan değerlendirilmesine olanak tanıyan sağlam genom mühendisliği araçlarından da yararlanır19. Bunun dikkate değer bir örneği, seçilebilir belirteçler olarak işlev görebilen MW00119 ve SK-120’nin urasil oksotrofik suşları gibi genetik olarak değiştirilmiş S. acidocaldarius suşlarının mevcudiyetidir.
S. acidocaldarius gibi termofillerle deneysel evrim yürütmede önemli zorluklar vardır. Bu çalışmalar için gerekli olan yüksek sıcaklıklarda uzun süreli inkübasyon, hem sıvı hem de katı kültür teknikleri için önemli ölçüde buharlaşma gerektirir. Yüksek sıcaklıklarda uzun süreli çalışma, sıvı ortamda deneysel evrimde yaygın olarak kullanılan geleneksel çalkalama inkübatörlerine de zarar verebilir. Birden fazla sıcaklığı keşfetmek, birkaç inkübatörün satın alınması ve bakımı için önemli bir finansal yatırım gerektirir. Ayrıca, gereken yüksek enerji tüketimi, önemli çevresel ve finansal kaygıları da beraberinde getirmektedir.
Bu çalışma, S. acidocaldarius gibi termofillerle deneysel evrim gerçekleştirirken karşılaşılan zorlukları ele almak için bir yöntem sunmaktadır. Baes ve ark. ısı şoku tepkisi 14,21’i araştırmak için, burada geliştirilen yöntem, tutarlı ve güvenilir yüksek sıcaklıkta inkübasyon için tezgah üstü termomikserleri kullanır. Ölçeklenebilirliği, ek inkübasyon ekipmanı edinme maliyetlerinin azalmasıyla birden fazla sıcaklık işleminin aynı anda değerlendirilmesine olanak tanır. Bu, termofillerde evrimsel dinamikleri etkileyen faktörlerin sağlam istatistiksel analizine ve kapsamlı bir şekilde araştırılmasına olanak tanıyarak deneysel verimliliği artırır22. Ayrıca bu yaklaşım, geleneksel kuluçka makinelerine kıyasla finansal ilk yatırımı ve enerji tüketimini önemli ölçüde azaltarak daha sürdürülebilir ve çevre dostu bir alternatif sunar.
Yöntemimiz, Dünya’daki yaşamın çeşitlenmesinin ilk aşamalarında kilit bir rol oynamış olabilecek aşırı sıcaklıklarla karakterize edilen ortamlarda evrimsel dinamikleri deneysel olarak araştırmak için zemin hazırlamaktadır. Termofilik organizmalar benzersiz özelliklere sahiptir, ancak aşırı büyüme koşulları ve özel gereksinimleri genellikle bir model sistem olarak erişilebilirliklerini sınırlamıştır. Bu engellerin üstesinden gelmek, yalnızca evrimsel dinamikleri araştırmak için araştırma fırsatlarını genişletmekle kalmaz, aynı zamanda termofillerin bilimsel araştırmalarda model sistemler olarak daha geniş kullanımını da artırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, termofiller için deneysel bir evrim protokolü geliştirdi, burada archaeon S. acidocaldarius için uyarlanmış, ancak yüksek sıcaklıkta büyüme gereksinimleri olan diğer mikroplara uyarlanabilir. Bu protokol, başlangıçta mezofilik bakteriler için tasarlanmış teknikler üzerine kuruludur, ancak yüksek sıcaklıkta aerobik büyüme ile ilişkili teknik zorlukların üstesinden gelmek için özel olarak modifiye edilmiştir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Prof SV Albers’e (Freiburg Üniversitesi), Prof Eveline Peeters’e (Vrije Universiteit Brussel) ve Dr Rani Baes’e (Vrije Universiteit Brussel) tavsiyeleri ve S. acidocaldarius DSM639 suşu için teşekkür eder. Bu çalışma, Royal Society Araştırma Bursu (DRG’ye verildi: RGS \ R1 \ 231308), bir UKRI-NERC “Sınırları Keşfetmek” Araştırma Bursu (DRG ve CGK’ya verildi: NE / X012662 / 1) ve bir Kuveyt Üniversitesi Doktora bursu (ZA’ya verildi).
Materials
| 0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
| 1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
| 1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
| 2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
| 200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
| 50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
| 50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
| 96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
| Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
| Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
| Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
| CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
| Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
| D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
| Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
| Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
| Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
| Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
| N-Z-Amine A – Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
| Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
| Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
| Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
| Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
| Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
| Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
| Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
References
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME J. 11 (10), 2181-2194 (2017).
- McDonald, M. J. Microbial experimental evolution – a proving ground for evolutionary theory and a tool for discovery. EMBO Rep. 20 (8), e46992 (2019).
- Van Den Bergh, B., Swings, T., Fauvart, M., Michiels, J. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev. 82 (3), e00008-e00018 (2018).
- McCarthy, S., et al. Expanding the limits of thermoacidophily in the archaeon Sulfolobus solfataricus by adaptive evolution. Appl Environ Microbiol. 82 (3), 857-867 (2016).
- Grogan, D. W. The question of DNA repair in hyperthermophilic archaea. Trends Microbiol. 8 (4), 180-185 (2000).
- Whitaker, R. J. Population dynamics through the lens of extreme environments. Rev Mineral Geochem. 59 (1), 259-277 (2005).
- Peeters, E., Thia-Toong, T. -. L., Gigot, D., Maes, D., Charlier, D. Ss-LrpB, a novel Lrp-like regulator of Sulfolobus solfataricus P2, binds cooperatively to three conserved targets in its own control region: Ss-LrpB-operator interactions for autoregulation. Mol Microbiol. 54 (2), 321-336 (2004).
- Quehenberger, J., Shen, L., Albers, S. -. V., Siebers, B., Spadiut, O. Sulfolobus – A potential key organism in future biotechnology. Front Microbiol. 8, 2474 (2017).
- Schultz, J., Dos Santos, A., Patel, N., Rosado, A. S. Life on the edge: Bioprospecting extremophiles for astrobiology. J Indian Inst Sci. 103 (3), 721-737 (2023).
- Chen, L., et al. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J Bacteriol. 187 (14), 4992-4999 (2005).
- Rastädter, K., Wurm, D. J., Spadiut, O., Quehenberger, J. Physiological characterization of Sulfolobus acidocaldarius in a controlled bioreactor environment. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5532 (2021).
- Baes, R., Lemmens, L., Mignon, K., Carlier, M., Peeters, E. Defining heat shock response for the thermoacidophilic model crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 24 (5), 681-692 (2020).
- Grogan, D. W. Hyperthermophiles and the problem of DNA instability. Mol Microbiol. 28 (6), 1043-1049 (1998).
- Grogan, D. W. Understanding DNA repair in hyperthermophilic archaea: Persistent gaps and other reasons to focus on the fork. Archaea. 2015, 942605 (2015).
- Drake, J. W. Avoiding dangerous missense: Thermophiles display especially low mutation rates. PLoS Genet. 5 (6), e1000520 (2009).
- Grogan, D. W., Carver, G. T., Drake, J. W. Genetic fidelity under harsh conditions: Analysis of spontaneous mutation in the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7928-7933 (2001).
- Wagner, M., et al. Versatile genetic tool box for the Crenarchaeote Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol. 3, 214 (2012).
- Suzuki, S., Kurosawa, N. Disruption of the gene encoding restriction endonuclease SuaI and development of a host-vector system for the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Extremophiles. 20 (2), 139-148 (2016).
- Baes, R., et al. Transcriptional and translational dynamics underlying heat shock response in the thermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. mBio. 14 (5), e0359322 (2023).
- González, A. G., Pérez Y Terrón, R. Importance of extremophilic microorganisms in biogeochemical cycles. GSC Adv Res Rev. 9 (1), 082-093 (2021).
- Brock, T. D., Brock, K. M., Belly, R. T., Weiss, R. L. Sulfolobus: A new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch Mikrobiol. 84 (1), 54-68 (1972).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. Am Nat. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- . Exploring transcriptional and translational regulatory mechanisms of the heat shock response of Sulfolobus acidocaldarius. Master’s Thesis Available from: https://researchportal.vub.be/en/studentTheses/exploring-transcriptional-and-translational-regulatory-mechanisms (2018)
- Wahl, L. M., Gerrish, P. J., Saika-Voivod, I. Evaluating the impact of population bottlenecks in experimental evolution. Genetics. 162 (2), 961-971 (2002).
- Bernander, R. The cell cycle of Sulfolobus. Mol Microbiol. 66 (3), 557-562 (2007).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- Frenzel, E., Legebeke, J., Van Stralen, A., Van Kranenburg, R., Kuipers, O. P. In vivo selection of sfGFP variants with improved and reliable functionality in industrially important thermophilic bacteria. Biotechnol Biofuels. 11, 8 (2018).
- Visone, V., et al. In vivo and in vitro protein imaging in thermophilic archaea by exploiting a novel protein tag. PLoS One. 12 (10), e0185791 (2017).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
