Estudo Comparativo de Matrizes de Membrana Basal para Manutenção de Células-Tronco Humanas e Geração de Organoides Intestinais
Summary
Os organoides tornaram-se ferramentas valiosas para a modelagem de doenças. A matriz extracelular (MEC) orienta o destino da célula durante a geração de organoides, e o uso de um sistema que se assemelha ao tecido nativo pode melhorar a precisão do modelo. Este estudo compara a geração de organoides intestinais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas em ECM derivada de animais e hidrogéis livres de xeno.
Abstract
A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crítico no comportamento e desenvolvimento celular. Organoides gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) estão no centro das atenções de muitas áreas de pesquisa. No entanto, a falta de pistas fisiológicas em materiais clássicos de cultura de células dificulta a diferenciação eficiente de iPSC. A incorporação da ECM disponível comercialmente na cultura de células-tronco fornece pistas físicas e químicas benéficas para a manutenção celular. Os produtos de membrana basal comercialmente disponíveis de origem animal são compostos de proteínas ECM e fatores de crescimento que suportam a manutenção celular. Como a ECM possui propriedades específicas do tecido que podem modular o destino celular, matrizes livres de xeno são usadas para transmitir a tradução para estudos clínicos. Embora as matrizes comercialmente disponíveis sejam amplamente utilizadas no trabalho com hiPSC e organoides, a equivalência dessas matrizes ainda não foi avaliada. Aqui, foi realizado um estudo comparativo da manutenção de hiPSC e geração de organoides intestinais humanos (hIO) em quatro matrizes diferentes: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Embora as colônias não tivessem uma forma perfeitamente redonda, houve uma diferenciação espontânea mínima, com mais de 85% das células expressando o marcador de células-tronco SSEA-4. A Matrix 4-XF levou à formação de aglomerados redondos 3D. Além disso, o aumento da concentração de suplemento e fatores de crescimento no meio usado para fazer a solução de hidrogel Matrix 4-XF melhorou a expressão de hiPSC de SSEA-4 em 1,3 vezes. A diferenciação do hiPSC mantido pela Matrix 2-AB levou a menos liberações de esferóides durante o estágio médio / intestino grosso em comparação com as outras membranas basais derivadas de animais. Em comparação com outras, a matriz organoide livre de xeno (Matriz 4-O3) leva a uma IO maior e mais madura, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides. Em conjunto, os resultados sugerem que variações na composição de diferentes matrizes afetam os estágios de diferenciação de IO. Este estudo aumenta a conscientização sobre as diferenças nas matrizes disponíveis comercialmente e fornece um guia para a otimização da matriz durante o trabalho de iPSC e IO.
Introduction
A matriz extracelular (MEC) é um componente dinâmico e multifuncional dos tecidos que desempenha um papel central na regulação do comportamento e desenvolvimento celular. Como uma rede complexa, fornece suporte estrutural, ligantes adesivos celulares1 e armazenamento de fatores de crescimento e citocinas que regulam a sinalização celular. Por exemplo, durante a cicatrização de feridas, a MEC serve como um andaime para células migratórias e como um reservatório de fatores de crescimento envolvidos no reparo tecidual2. Da mesma forma, a desregulação na MEC pode levar a um aumento na gravidade de várias doenças, como fibrose e câncer 3,4. Durante o desenvolvimento embrionário, a MEC orienta a morfogênese do tecido. Por exemplo, no desenvolvimento do coração, os componentes da ECM desempenham um papel na criação da arquitetura e função corretas do tecido cardíaco5. Mais de uma década de pesquisa mostrou que a rigidez do microambiente por si só 6,7 pode controlar a especificação da linhagem de células-tronco. Portanto, não é surpreendente que, durante a diferenciação celular in vitro, a ECM influencie o destino das células-tronco, fornecendo sinais para diferenciação.
Os organoides podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Começar com uma linha iPSC devidamente caracterizada é necessário para gerar organoides com sucesso. No entanto, a falta de pistas fisiológicas em materiais clássicos de cultura de células dificulta a diferenciação eficiente de iPSC e a geração de organoides. Além disso, pesquisas recentes enfatizaram a importância da composição da matriz extracelular (MEC), interações entre as células e a MEC8, bem como pistas mecânicas e geométricas 9,10,11 no contexto da expansão e diferenciação de organoides12. O avanço da tecnologia organoide, melhorando a reprodutibilidade, envolverá a incorporação de pistas físicas e químicas específicas do tecido.
Os organoides visam recapitular o tecido nativo dentro de um microambiente fisiologicamente semelhante. A escolha de um sistema de ECM que imite de perto a ECM do tecido nativo é crucial para alcançar relevância fisiológica em relação ao comportamento, função e resposta celular a estímulos13. A escolha dos componentes da ECM pode influenciar a diferenciação de células-tronco em tipos específicos de células dentro do organoide. Diferentes proteínas ECM e suas combinações podem fornecer pistas que orientam o destino celular14. Por exemplo, estudos mostraram que o uso de componentes específicos da ECM pode promover a diferenciação de células-tronco intestinais em tipos de células intestinais maduras, resultando em organoides intestinais fisiologicamente relevantes15. Embora os organoides sejam uma ferramenta valiosa durante a modelagem de doenças e testes de drogas, a seleção de um sistema de ECM apropriado é fundamental para esta aplicação. Um sistema de ECM apropriado pode aumentar a precisão da modelagem da doença, criando um microambiente que se assemelha ao tecido afetado16. Além disso, a ECM específica do tecido pode ajudar a gerar organoides que recapitulam melhor os fenótipos associados à doença e as respostas aos medicamentos17. A otimização do sistema ECM usado na diferenciação de organoides é fundamental para alcançar os resultados de diferenciação desejados.
Sistemas de membrana basal disponíveis comercialmente derivados de fontes animais de ECM (por exemplo, Matrigel, Cultrex) e hidrogel livre de xeno (por exemplo, VitroGel) são amplamente utilizados em pesquisas de iPSC e organoides. As empresas que os comercializam e os pesquisadores que os utilizam estabeleceram muitas instruções para seus produtos e aplicações específicas ao longo dos anos. Muitas dessas instruções serviram de guia para a geração desse protocolo. Além disso, os benefícios e contratempos associados às suas propriedades intrínsecas têm sido observados individualmente por muitos 18,19,20,21. No entanto, não existe um fluxo de trabalho sistemático para orientar a seleção de sistemas ideais para o trabalho com iPSC e organoides. Aqui, é fornecido um fluxo de trabalho para avaliar sistematicamente a equivalência de sistemas ECM de várias fontes para iPSC e trabalho com organoides. Este é um estudo comparativo da manutenção de duas diferentes linhagens de iPSC humanas (hiPSC) e geração de organoides intestinais humanos (hIO) em quatro matrizes diferentes: Matrigel (Matriz 1-AB), Geltrex (Matriz 2-AB), Cultrex (Matriz 3-AB) e VitroGel (Matriz 4-XF). Para a cultura de organoides, foram utilizadas quatro versões da matriz VitroGel sem xeno, previamente otimizadas para cultura de organoides: ORGANOIDE 1 (Matriz 4-O1), ORGANOIDE 2 (Matriz 4-O2), ORGANOIDE 3 (Matriz 4-O3), ORGANOIDE 4 (Matriz 4-O4). Além disso, foram utilizadas matrizes de origem animal otimizadas para organoides: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) e Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Foram utilizados meios de cultura de células-tronco disponíveis comercialmente (mTeSR Plus) e kit de diferenciação de organoides (kit organoide intestinal STEMdiff). Este protocolo combina as instruções individuais dos fabricantes dos produtos com experiências de laboratório para orientar o leitor em direção a uma otimização bem-sucedida do ECM para seu trabalho específico de iPSC e organoide. Em conjunto, este protocolo e os resultados representativos enfatizam a importância de selecionar o microambiente ideal para o trabalho com células-tronco e diferenciação de organoides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selecionar o microambiente ideal para o trabalho com células-tronco e organoides é um passo inicial fundamental ao usar essas plataformas para uma ampla gama de aplicações. Nossos resultados representativos mostram que a Matriz 4-XFO3, em combinação com uma maior concentração de fatores de crescimento, leva a organoides maiores, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides usando esses sistemas. Foi demonstrado anteriormente qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o treinamento anterior e as recomendações gerais sobre o início do trabalho com hiPSC e organoides dos Drs. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano e Russell D’Souza. Eles agradecem à Dra. Chelsey Simmons por sua orientação no uso de sistemas de hidrogel para trabalhos de cultura de células in vitro . Além disso, os autores gostariam de agradecer aos Drs. Christine Rodriguez e Thomas Allison, da STEMCELL Technologies, por sua orientação sobre a cultura hiPSC. Os autores também agradecem à TheWell Bioscience por cobrir os custos de publicação.
Materials
| 24-Well Plate (Culture treated, sterile) | Falcon | 353504 | |
| 37 °C water bath | VWR | ||
| 96-well plate | Fisher Scientific | FB012931 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
| Anti-adherence Rinsing Solutio | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| Biological safety cabinet (BSC) | Labconco | Logic | |
| Brightfield Microscope | Echo Rebel | REB-01-E2 | |
| BXS0116 | ATCC | ACS-1030 | |
| Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) | ThermoScientific | 75002441 | |
| Conical tubes, 15 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes, 50 mL, sterile | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Cultrex RGF BME, Type 2 | Bio-techne | 3533-005-02 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME | Bio-techne | 3434-010-02 | |
| D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor | Gibco | A14133-02 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
| Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) | Luminex | 0500-3115 | |
| HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
| Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Scientific | 51033775 | |
| JMP Software | SAS Institute | JMP 16 | |
| MATLAB | MathWorks, Inc | R2022b | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free | Corning | 356231 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free | Corning | 354263 | |
| mTeSR Plus Medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | |
| Nunclon Delta surface treated 24-well plate | Thermo Scientific | 144530 | |
| PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) | BD Pharmingen | 566841 | |
| PE Mouse Anti-human CDX2 | BD Pharmingen | 563428 | |
| PE Mouse Anti-human FOXA2 | BD Pharmingen | 561589 | |
| PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4 | BD Pharmingen | 561565 | |
| ReLeSR | STEMCELL | 5872 | |
| SCTi003-A | STEMCELL Technologies | 200-0510 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium | STEMCELL Technologies | 5145 | |
| STEMdiff Intestinal Organoid Kit | STEMCELL Technologies | 5140 | |
| Vitrogel Hydrogel Matrix | TheWell Bioscience | VHM01 | |
| VitroGel ORGANOID Discovery Kit | TheWell Bioscience | VHM04-K |
References
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