Summary

Estudo Comparativo de Matrizes de Membrana Basal para Manutenção de Células-Tronco Humanas e Geração de Organoides Intestinais

Published: March 15, 2024
doi:

Summary

Os organoides tornaram-se ferramentas valiosas para a modelagem de doenças. A matriz extracelular (MEC) orienta o destino da célula durante a geração de organoides, e o uso de um sistema que se assemelha ao tecido nativo pode melhorar a precisão do modelo. Este estudo compara a geração de organoides intestinais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas em ECM derivada de animais e hidrogéis livres de xeno.

Abstract

A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crítico no comportamento e desenvolvimento celular. Organoides gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) estão no centro das atenções de muitas áreas de pesquisa. No entanto, a falta de pistas fisiológicas em materiais clássicos de cultura de células dificulta a diferenciação eficiente de iPSC. A incorporação da ECM disponível comercialmente na cultura de células-tronco fornece pistas físicas e químicas benéficas para a manutenção celular. Os produtos de membrana basal comercialmente disponíveis de origem animal são compostos de proteínas ECM e fatores de crescimento que suportam a manutenção celular. Como a ECM possui propriedades específicas do tecido que podem modular o destino celular, matrizes livres de xeno são usadas para transmitir a tradução para estudos clínicos. Embora as matrizes comercialmente disponíveis sejam amplamente utilizadas no trabalho com hiPSC e organoides, a equivalência dessas matrizes ainda não foi avaliada. Aqui, foi realizado um estudo comparativo da manutenção de hiPSC e geração de organoides intestinais humanos (hIO) em quatro matrizes diferentes: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Embora as colônias não tivessem uma forma perfeitamente redonda, houve uma diferenciação espontânea mínima, com mais de 85% das células expressando o marcador de células-tronco SSEA-4. A Matrix 4-XF levou à formação de aglomerados redondos 3D. Além disso, o aumento da concentração de suplemento e fatores de crescimento no meio usado para fazer a solução de hidrogel Matrix 4-XF melhorou a expressão de hiPSC de SSEA-4 em 1,3 vezes. A diferenciação do hiPSC mantido pela Matrix 2-AB levou a menos liberações de esferóides durante o estágio médio / intestino grosso em comparação com as outras membranas basais derivadas de animais. Em comparação com outras, a matriz organoide livre de xeno (Matriz 4-O3) leva a uma IO maior e mais madura, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides. Em conjunto, os resultados sugerem que variações na composição de diferentes matrizes afetam os estágios de diferenciação de IO. Este estudo aumenta a conscientização sobre as diferenças nas matrizes disponíveis comercialmente e fornece um guia para a otimização da matriz durante o trabalho de iPSC e IO.

Introduction

A matriz extracelular (MEC) é um componente dinâmico e multifuncional dos tecidos que desempenha um papel central na regulação do comportamento e desenvolvimento celular. Como uma rede complexa, fornece suporte estrutural, ligantes adesivos celulares1 e armazenamento de fatores de crescimento e citocinas que regulam a sinalização celular. Por exemplo, durante a cicatrização de feridas, a MEC serve como um andaime para células migratórias e como um reservatório de fatores de crescimento envolvidos no reparo tecidual2. Da mesma forma, a desregulação na MEC pode levar a um aumento na gravidade de várias doenças, como fibrose e câncer 3,4. Durante o desenvolvimento embrionário, a MEC orienta a morfogênese do tecido. Por exemplo, no desenvolvimento do coração, os componentes da ECM desempenham um papel na criação da arquitetura e função corretas do tecido cardíaco5. Mais de uma década de pesquisa mostrou que a rigidez do microambiente por si só 6,7 pode controlar a especificação da linhagem de células-tronco. Portanto, não é surpreendente que, durante a diferenciação celular in vitro, a ECM influencie o destino das células-tronco, fornecendo sinais para diferenciação.

Os organoides podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Começar com uma linha iPSC devidamente caracterizada é necessário para gerar organoides com sucesso. No entanto, a falta de pistas fisiológicas em materiais clássicos de cultura de células dificulta a diferenciação eficiente de iPSC e a geração de organoides. Além disso, pesquisas recentes enfatizaram a importância da composição da matriz extracelular (MEC), interações entre as células e a MEC8, bem como pistas mecânicas e geométricas 9,10,11 no contexto da expansão e diferenciação de organoides12. O avanço da tecnologia organoide, melhorando a reprodutibilidade, envolverá a incorporação de pistas físicas e químicas específicas do tecido.

Os organoides visam recapitular o tecido nativo dentro de um microambiente fisiologicamente semelhante. A escolha de um sistema de ECM que imite de perto a ECM do tecido nativo é crucial para alcançar relevância fisiológica em relação ao comportamento, função e resposta celular a estímulos13. A escolha dos componentes da ECM pode influenciar a diferenciação de células-tronco em tipos específicos de células dentro do organoide. Diferentes proteínas ECM e suas combinações podem fornecer pistas que orientam o destino celular14. Por exemplo, estudos mostraram que o uso de componentes específicos da ECM pode promover a diferenciação de células-tronco intestinais em tipos de células intestinais maduras, resultando em organoides intestinais fisiologicamente relevantes15. Embora os organoides sejam uma ferramenta valiosa durante a modelagem de doenças e testes de drogas, a seleção de um sistema de ECM apropriado é fundamental para esta aplicação. Um sistema de ECM apropriado pode aumentar a precisão da modelagem da doença, criando um microambiente que se assemelha ao tecido afetado16. Além disso, a ECM específica do tecido pode ajudar a gerar organoides que recapitulam melhor os fenótipos associados à doença e as respostas aos medicamentos17. A otimização do sistema ECM usado na diferenciação de organoides é fundamental para alcançar os resultados de diferenciação desejados.

Sistemas de membrana basal disponíveis comercialmente derivados de fontes animais de ECM (por exemplo, Matrigel, Cultrex) e hidrogel livre de xeno (por exemplo, VitroGel) são amplamente utilizados em pesquisas de iPSC e organoides. As empresas que os comercializam e os pesquisadores que os utilizam estabeleceram muitas instruções para seus produtos e aplicações específicas ao longo dos anos. Muitas dessas instruções serviram de guia para a geração desse protocolo. Além disso, os benefícios e contratempos associados às suas propriedades intrínsecas têm sido observados individualmente por muitos 18,19,20,21. No entanto, não existe um fluxo de trabalho sistemático para orientar a seleção de sistemas ideais para o trabalho com iPSC e organoides. Aqui, é fornecido um fluxo de trabalho para avaliar sistematicamente a equivalência de sistemas ECM de várias fontes para iPSC e trabalho com organoides. Este é um estudo comparativo da manutenção de duas diferentes linhagens de iPSC humanas (hiPSC) e geração de organoides intestinais humanos (hIO) em quatro matrizes diferentes: Matrigel (Matriz 1-AB), Geltrex (Matriz 2-AB), Cultrex (Matriz 3-AB) e VitroGel (Matriz 4-XF). Para a cultura de organoides, foram utilizadas quatro versões da matriz VitroGel sem xeno, previamente otimizadas para cultura de organoides: ORGANOIDE 1 (Matriz 4-O1), ORGANOIDE 2 (Matriz 4-O2), ORGANOIDE 3 (Matriz 4-O3), ORGANOIDE 4 (Matriz 4-O4). Além disso, foram utilizadas matrizes de origem animal otimizadas para organoides: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) e Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Foram utilizados meios de cultura de células-tronco disponíveis comercialmente (mTeSR Plus) e kit de diferenciação de organoides (kit organoide intestinal STEMdiff). Este protocolo combina as instruções individuais dos fabricantes dos produtos com experiências de laboratório para orientar o leitor em direção a uma otimização bem-sucedida do ECM para seu trabalho específico de iPSC e organoide. Em conjunto, este protocolo e os resultados representativos enfatizam a importância de selecionar o microambiente ideal para o trabalho com células-tronco e diferenciação de organoides.

Protocol

1. manutenção hiPSC CUIDADO: Todo o trabalho é feito em um Gabinete de Biossegurança (BSC) seguindo técnicas assépticas padrão. Deve seguir os padrões de segurança da OSHA para laboratórios, incluindo o uso adequado de equipamentos de proteção individual, como jalecos, luvas e óculos de proteção. Preparação de matrizes, alíquotas e meios de cultura celularPara membranas basais (BMs) derivadas de animais disponíveis comercialmente; Matriz 1-…

Representative Results

Seguindo este protocolo, membranas basais disponíveis comercialmente e um sistema de hidrogel livre de xeno foram utilizados com sucesso para cultivar células hiPSC e diferenciá-las em hIO. O principal objetivo desses experimentos foi avaliar sistematicamente a equivalência de matrizes de várias fontes para o trabalho de hiPSC e hIO. A primeira seção deste protocolo enfocou a manutenção e caracterização de uma cultura de iPSC saudável que produz uma geração eficiente de organoides intestinais. O processo de…

Discussion

Selecionar o microambiente ideal para o trabalho com células-tronco e organoides é um passo inicial fundamental ao usar essas plataformas para uma ampla gama de aplicações. Nossos resultados representativos mostram que a Matriz 4-XFO3, em combinação com uma maior concentração de fatores de crescimento, leva a organoides maiores, sugerindo que as propriedades físicas dos hidrogéis livres de xeno podem ser aproveitadas para otimizar a geração de organoides usando esses sistemas. Foi demonstrado anteriormente qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o treinamento anterior e as recomendações gerais sobre o início do trabalho com hiPSC e organoides dos Drs. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano e Russell D’Souza. Eles agradecem à Dra. Chelsey Simmons por sua orientação no uso de sistemas de hidrogel para trabalhos de cultura de células in vitro . Além disso, os autores gostariam de agradecer aos Drs. Christine Rodriguez e Thomas Allison, da STEMCELL Technologies, por sua orientação sobre a cultura hiPSC. Os autores também agradecem à TheWell Bioscience por cobrir os custos de publicação.

Materials

24-Well Plate (Culture treated, sterile) Falcon 353504
37 °C water bath VWR
96-well plate  Fisher Scientific FB012931
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634
Anti-adherence Rinsing Solutio STEMCELL Technologies 7010
Biological safety cabinet (BSC) Labconco  Logic
Brightfield Microscope Echo Rebel REB-01-E2
BXS0116 ATCC ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) ThermoScientific 75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339650
Conical tubes, 50 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339652
Cultrex RGF BME, Type 2 Bio-techne 3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME  Bio-techne 3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) Thermo Fisher Scientific 14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor Gibco  A14133-02
GlutaMAX Supplement Thermo Fischer Scientific 35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) Luminex 0500-3115
HEPES buffer solution Thermo Fischer Scientific 15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) Thermo Scientific  51033775
JMP Software SAS Institute JMP 16
MATLAB MathWorks, Inc R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free Corning  356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free Corning  354263
mTeSR Plus Medium STEMCELL Technologies 100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate Thermo Scientific 144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) BD Pharmingen 566841
PE Mouse Anti-human CDX2  BD Pharmingen 563428
PE Mouse Anti-human FOXA2 BD Pharmingen 561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4  BD Pharmingen 561565
ReLeSR STEMCELL 5872
SCTi003-A STEMCELL Technologies 200-0510
Serological pipettes (10 mL)  Fisher Scientific 13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)  Fisher Scientific 13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium STEMCELL Technologies 5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit STEMCELL Technologies 5140
Vitrogel Hydrogel Matrix TheWell Bioscience VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit TheWell Bioscience VHM04-K

References

  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
  3. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78 (2010).
  4. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
  5. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  6. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  8. Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306 (2022).
  9. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  10. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  11. Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
  12. Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
  13. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  17. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  18. Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
  19. Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024)
  20. biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
  21. VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024)
  22. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  23. Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
  24. Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30 (2020).
  25. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).
  26. Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377 (2018).
  27. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  28. Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621 (2018).
  29. Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905 (2014).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Play Video

Cite This Article
Pineiro-Llanes, J., da Silva, L., Huang, J., Cristofoletti, R. Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation. J. Vis. Exp. (205), e66277, doi:10.3791/66277 (2024).

View Video