Summary

Estudio comparativo de matrices de membrana basal para el mantenimiento de células madre humanas y la generación de organoides intestinales

Published: March 15, 2024
doi:

Summary

Los organoides se han convertido en herramientas valiosas para el modelado de enfermedades. La matriz extracelular (ECM) guía el destino de las células durante la generación de organoides, y el uso de un sistema que se asemeje al tejido nativo puede mejorar la precisión del modelo. Este estudio compara la generación de organoides intestinales humanos derivados de células madre pluripotentes inducidas en ECM de origen animal e hidrogeles libres de xeno.

Abstract

La matriz extracelular (MEC) desempeña un papel fundamental en el comportamiento y el desarrollo celular. Los organoides generados a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) están en el punto de mira de muchas áreas de investigación. Sin embargo, la falta de señales fisiológicas en los materiales de cultivo celular clásicos dificulta la diferenciación eficiente de iPSC. La incorporación de ECM disponible comercialmente en el cultivo de células madre proporciona señales físicas y químicas beneficiosas para el mantenimiento celular. Los productos de membrana basal de origen animal disponibles en el mercado están compuestos por proteínas ECM y factores de crecimiento que apoyan el mantenimiento celular. Dado que la MEC tiene propiedades específicas de los tejidos que pueden modular el destino de las células, se utilizan matrices libres de xeno para transmitir la traducción a los estudios clínicos. Si bien las matrices disponibles comercialmente se utilizan ampliamente en el trabajo de hiPSC y organoides, aún no se ha evaluado la equivalencia de estas matrices. En este trabajo se realizó un estudio comparativo del mantenimiento de hiPSC y la generación de organoides intestinales humanos (hIO) en cuatro matrices diferentes: Matrigel (Matriz 1-AB), Geltrex (Matriz 2-AB), Cultrex (Matriz 3-AB) y VitroGel (Matriz 4-XF). Aunque las colonias carecían de una forma perfectamente redonda, hubo una diferenciación espontánea mínima, con más del 85% de las células expresando el marcador de células madre SSEA-4. Matrix 4-XF condujo a la formación de grupos redondos en 3D. Además, el aumento de la concentración de suplementos y factores de crecimiento en los medios utilizados para fabricar la solución de hidrogel Matrix 4-XF mejoró la expresión de hiPSC de SSEA-4 en 1,3 veces. La diferenciación de la hiPSC mantenida por Matrix 2-AB condujo a menos liberaciones de esferoides durante la etapa del intestino medio/posterior en comparación con las otras membranas basales derivadas de animales. En comparación con otros, la matriz de organoides libres de xeno (Matriz 4-O3) conduce a hIO más grande y maduro, lo que sugiere que las propiedades físicas de los hidrogeles libres de xeno se pueden aprovechar para optimizar la generación de organoides. En conjunto, los resultados sugieren que las variaciones en la composición de diferentes matrices afectan a las etapas de diferenciación de la IO. Este estudio crea conciencia sobre las diferencias en las matrices disponibles comercialmente y proporciona una guía para la optimización de matrices durante el trabajo de iPSC e IO.

Introduction

La matriz extracelular (MEC) es un componente dinámico y multifuncional de los tejidos que desempeña un papel central en la regulación del comportamiento y el desarrollo celular. Como una red compleja, proporciona soporte estructural, ligandos adhesivos celulares1 y almacenamiento de factores de crecimiento y citocinas que regulan la señalización celular. Por ejemplo, durante la cicatrización de heridas, la MEC sirve como andamio para las células migratorias y como reservorio de factores de crecimiento implicados enla reparación de los tejidos. Del mismo modo, la desregulación en la MEC puede conducir a un aumento de la gravedad de diversas enfermedades como la fibrosis y el cáncer 3,4. Durante el desarrollo embrionario, la MEC guía la morfogénesis de los tejidos. Por ejemplo, en el desarrollo del corazón, los componentes de la MEC desempeñan un papel en la creación de la arquitectura y la función correctas del tejido cardíaco5. Más de una década de investigación ha demostrado que la rigidez del microambiente por sí sola 6,7 puede controlar la especificación del linaje de células madre. Por lo tanto, no es sorprendente que durante la diferenciación celular in vitro, la MEC influya en el destino de las células madre al proporcionar señales para la diferenciación.

Los organoides se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Es necesario comenzar con una línea de iPSC debidamente caracterizada para generar organoides con éxito. Sin embargo, la falta de señales fisiológicas en los materiales de cultivo celular clásicos dificulta la diferenciación eficiente de iPSC y la generación de organoides. Además, investigaciones recientes han enfatizado la importancia de la composición de la matriz extracelular (MEC), las interacciones entre las células y la MEC8, así como las señales mecánicas y geométricas 9,10,11 en el contexto de la expansión y diferenciación de organoides12. El avance de la tecnología de organoides mediante la mejora de la reproducibilidad implicará la incorporación de señales físicas y químicas específicas de los tejidos.

Los organoides tienen como objetivo recapitular el tejido nativo dentro de un microambiente fisiológicamente similar. La elección de un sistema de MEC que imite de cerca la MEC del tejido nativo es crucial para lograr la relevancia fisiológica con respecto al comportamiento, la función y la respuesta de las células a los estímulos13. La elección de los componentes de la MEC puede influir en la diferenciación de las células madre en tipos celulares específicos dentro del organoide. Diferentes proteínas de la MEC y sus combinaciones pueden proporcionar pistas que guíanel destino de las células. Por ejemplo, los estudios han demostrado que el uso de componentes específicos de la MEC puede promover la diferenciación de las células madre intestinales en tipos de células intestinales maduras, lo que da como resultado organoides intestinales fisiológicamente relevantes15. Si bien los organoides son una herramienta valiosa durante el modelado de enfermedades y las pruebas de fármacos, la selección de un sistema ECM adecuado es fundamental para esta aplicación. Un sistema de ECM adecuado puede mejorar la precisión del modelado de la enfermedad mediante la creación de un microambiente que se asemeja al tejido afectado16. Además, la MEC específica de tejido puede ayudar a generar organoides que recapitulan mejor los fenotipos asociados a la enfermedad y las respuestas a los fármacos17. La optimización del sistema ECM utilizado en la diferenciación de organoides es fundamental para lograr los resultados de diferenciación deseados.

Los sistemas de membranas basales disponibles en el mercado derivados de fuentes animales de ECM (por ejemplo, Matrigel, Cultrex) y el hidrogel libre de xeno (por ejemplo, VitroGel) se utilizan ampliamente en la investigación de iPSC y organoides. Las empresas que los comercializan y los investigadores que los utilizan han establecido muchas instrucciones para sus productos y aplicaciones específicas a lo largo de los años. Muchas de estas instrucciones sirvieron de guía para la generación de este protocolo. Además, los beneficios y contratiempos asociados con sus propiedades intrínsecas han sido señalados individualmente por muchos 18,19,20,21. Sin embargo, no existe un flujo de trabajo sistemático que guíe la selección de sistemas óptimos para el trabajo con iPSC y organoides. Aquí, se proporciona un flujo de trabajo para evaluar sistemáticamente la equivalencia de los sistemas ECM de varias fuentes para el trabajo con iPSC y organoides. Se trata de un estudio comparativo del mantenimiento de dos líneas diferentes de iPSC humanas (hiPSC) y de la generación de organoides intestinales humanos (hIO) en cuatro matrices diferentes: Matrigel (Matriz 1-AB), Geltrex (Matriz 2-AB), Cultrex (Matriz 3-AB) y VitroGel (Matriz 4-XF). Para el cultivo de organoides, se utilizaron cuatro versiones de la matriz libre de xeno VitroGel que previamente estaban optimizadas para el cultivo de organoides: ORGANOIDE 1 (Matriz 4-O1), ORGANOIDE 2 (Matriz 4-O2), ORGANOIDE 3 (Matriz 4-O3), ORGANOIDE 4 (Matriz 4-O4). Además, se utilizaron matrices de origen animal optimizadas para organoides: Matrigel Alta Concentración (Matriz 1-ABO) y Cultrex Tipo 2 (Matriz 3-ABO). Se utilizaron medios de cultivo de células madre disponibles en el mercado (mTeSR Plus) y un kit de diferenciación de organoides (kit de organoides intestinales STEMdiff). Este protocolo combina las instrucciones individuales de los fabricantes de los productos con las experiencias de laboratorio para guiar al lector hacia una optimización exitosa de ECM para su trabajo específico de iPSC y organoides. En conjunto, este protocolo y los resultados representativos enfatizan la importancia de seleccionar el microambiente óptimo para el trabajo con células madre y la diferenciación de organoides.

Protocol

1. Mantenimiento de hiPSC PRECAUCIÓN: Todos los trabajos se realizan en una cabina de bioseguridad (BSC) siguiendo las técnicas asépticas estándar. Debe seguir las normas de seguridad de OSHA para laboratorios, incluido el uso adecuado de equipo de protección personal como batas de laboratorio, guantes y gafas. Preparación de matrices, alícuotas y medios de cultivo celularEn el caso de las membranas basales de origen animal disponibles en el mercado; M…

Representative Results

Siguiendo este protocolo, se utilizaron con éxito membranas basales disponibles en el mercado y un sistema de hidrogel libre de xeno para cultivar células hiPSC y diferenciarlas en hIO. El objetivo principal de estos experimentos fue evaluar sistemáticamente la equivalencia de matrices de diversas fuentes para el trabajo de hiPSC y hIO. La primera sección de este protocolo se centró en el mantenimiento y caracterización de un cultivo de iPSC saludable que produce una generación eficiente de organoides intestinales…

Discussion

La selección del microentorno óptimo para el trabajo con células madre y organoides es un primer paso fundamental cuando se utilizan estas plataformas para una amplia gama de aplicaciones. Nuestros resultados representativos muestran que la matriz 4-XFO3, en combinación con una mayor concentración de factores de crecimiento, conduce a organoides más grandes, lo que sugiere que las propiedades físicas de los hidrogeles libres de xeno se pueden aprovechar para optimizar la generación de organoides utilizando estos …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen la capacitación previa y las recomendaciones generales sobre el inicio del trabajo con hiPSC y organoides de los doctores Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano y Russell D’Souza. Agradecen a la Dra. Chelsey Simmons por su orientación en el uso de sistemas de hidrogel para el trabajo de cultivo celular in vitro . Además, los autores desean agradecer a los doctores Christine Rodriguez y Thomas Allison de STEMCELL Technologies por su orientación sobre el cultivo de hiPSC. Los autores también agradecen a TheWell Bioscience por cubrir los costos de publicación.

Materials

24-Well Plate (Culture treated, sterile) Falcon 353504
37 °C water bath VWR
96-well plate  Fisher Scientific FB012931
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634
Anti-adherence Rinsing Solutio STEMCELL Technologies 7010
Biological safety cabinet (BSC) Labconco  Logic
Brightfield Microscope Echo Rebel REB-01-E2
BXS0116 ATCC ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) ThermoScientific 75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339650
Conical tubes, 50 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339652
Cultrex RGF BME, Type 2 Bio-techne 3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME  Bio-techne 3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) Thermo Fisher Scientific 14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor Gibco  A14133-02
GlutaMAX Supplement Thermo Fischer Scientific 35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) Luminex 0500-3115
HEPES buffer solution Thermo Fischer Scientific 15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) Thermo Scientific  51033775
JMP Software SAS Institute JMP 16
MATLAB MathWorks, Inc R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free Corning  356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free Corning  354263
mTeSR Plus Medium STEMCELL Technologies 100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate Thermo Scientific 144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) BD Pharmingen 566841
PE Mouse Anti-human CDX2  BD Pharmingen 563428
PE Mouse Anti-human FOXA2 BD Pharmingen 561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4  BD Pharmingen 561565
ReLeSR STEMCELL 5872
SCTi003-A STEMCELL Technologies 200-0510
Serological pipettes (10 mL)  Fisher Scientific 13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)  Fisher Scientific 13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium STEMCELL Technologies 5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit STEMCELL Technologies 5140
Vitrogel Hydrogel Matrix TheWell Bioscience VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit TheWell Bioscience VHM04-K

References

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Pineiro-Llanes, J., da Silva, L., Huang, J., Cristofoletti, R. Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation. J. Vis. Exp. (205), e66277, doi:10.3791/66277 (2024).

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