En sømløs kloningstilnærming for svinereproduktivt og respiratorisk syndrom virusekspresjonsvektorkonstruksjon
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å oppnå pVAX1-PRRSV-ekspresjonsvektoren ved å introdusere passende restriksjonssteder i 3′-enden av innsatsene. Vi kan linearisere vektoren og koble DNA-fragmenter til vektoren én etter én gjennom homolog rekombinasjonsteknologi.
Abstract
Konstruksjonen av genekspresjonsvektorer er en viktig komponent i laboratoriearbeid i eksperimentell biologi. Med tekniske fremskritt som Gibson Assembly blir vektorkonstruksjon relativt enkel og effektiv. Men når genomet i full lengde til Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) ikke lett kan amplifiseres av en enkelt polymerasekjedereaksjon (PCR) fra cDNA, eller det er vanskelig å skaffe seg en genekspresjonsvektor i full lengde ved homolog rekombinasjon av flere innsatser in vitro, klarer ikke den nåværende Gibson Assembly-teknikken å oppnå dette målet.
Følgelig hadde vi som mål å dele PRRSV-genomet i flere fragmenter og introdusere passende restriksjonssteder i den omvendte primeren for å oppnå PCR-amplifiserte fragmenter. Etter å ha sammenføyd det forrige DNA-fragmentet inn i vektoren ved hjelp av homolog rekombinasjonsteknologi, fikk den nye vektoren restriksjonsenzymets spaltningssted. Dermed kan vi linearisere vektoren ved å bruke det nylig tilsatte enzymspaltningsstedet og introdusere det neste DNA-fragmentet nedstrøms for oppstrøms DNA-fragmentet.
Det introduserte restriksjonsenzymspaltningsstedet i 3′-enden av oppstrøms DNA-fragmentet vil bli eliminert, og et nytt spaltningssted vil bli introdusert i 3′-enden av nedstrøms DNA-fragmentet. På denne måten kan vi koble DNA-fragmenter til vektoren en etter en. Denne metoden er anvendelig for å lykkes med å konstruere PRRSV-ekspresjonsvektoren og er en effektiv metode for å sette sammen et stort antall fragmenter i ekspresjonsvektoren.
Introduction
Som en essensiell teknikk for å konstruere DNA-baserte eksperimentelle verktøy for ekspresjon i prokaryote og eukaryote celler, er molekylær kloning en svært viktig komponent i eksperimentell biologi. Molekylær kloning involverer fire prosesser: anskaffelse av innsats-DNA, ligering av innsatsen til riktig vektor, transformasjon av den rekombinante vektoren til Escherichia coli (E. coli), og identifikasjon av de positive klonene1. Så langt har flere metoder blitt tatt i bruk for å sammenføye DNA-molekyler ved å bruke restriksjonsenzymer 2,3 og PCR-mediert rekombinasjon 4,5,6. Homolog rekombinasjon, kjent som sømløs kloningsteknologi, er gruppen av kloningsmetoder, som tillater sekvensuavhengig og arrfri innsetting av ett eller flere fragmenter av DNA i en vektor. Denne teknologien inkluderer sekvens- og ligeringsuavhengig kloning (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion og Gibson Assembly. Den bruker en eksonuklease for å bryte ned en tråd av innsatsen og en vektor for å generere sammenhengende ender, og enten in vivo-reparasjon eller in vitro-rekombinasjon for kovalent å koble innsatsen til vektoren ved å danne fosfodiesterbindinger. Muligheten til å koble et enkelt innlegg til en vektor i hvilken som helst sekvens uten arr er veldig tiltalende. Videre har teknologien muligheten til å slå sammen 5-10 fragmenter i en forhåndsbestemt rekkefølge uten sekvensbegrensninger.
Som en av mange rekombinante DNA-teknikker er Gibson Assembly-teknikken, for tiden den mest effektive kloningsmetoden 7,8, en robust og elegant eksonukleasebasert metode for å sette sammen ett eller flere lineariserte DNA-fragmenter sømløst. Gibson Assembly-reaksjonen utføres under isotermiske forhold ved bruk av en blanding av tre enzymer, nemlig 5′ eksonuklease, high-fidelity polymerase og en termostabil DNA-ligase. Enkeltstrengede 3′ overheng skapt av 5′-3′ eksonuklease bidrar til gløding av fragmenter som deler komplementaritet i den ene enden. High-fidelity-polymerasen fyller effektivt hullene i de glødede enkelttrådsregionene ved å tilsette dNTP-er, og den termostabile DNA-ligasen forsegler hakkene for å danne felles DNA-molekyler8. Derfor har denne tekniske metoden blitt mye brukt for konstruksjon av genekspresjonsvektorer.
Reproduksjons- og respiratorisk syndrom hos svin (PRRS) er en virussykdom som fører til nedsatt reproduksjonsevne og respirasjonssvikt hos griser forårsaket av PRRSV i alle år9. Syndromet manifesteres som feber, anoreksi, lungebetennelse, sløvhet, depresjon og luftveisbesvær. Videre har kliniske tegn, inkludert rød/blå misfarging av ørene, blitt observert i noen epidemier. Som medlem av familien arterivirus overføres PRRSV i stor grad til svinekjøttproduserende land ved direkte kontakt og utveksling av væsker, inkludert urin, råmelk og spytt. På grunn av spredningen av PRRSV i USA, har de totale økonomiske tapene til svinekjøttindustrien blitt estimert til å være omtrent 664 millioner dollar per år, basert på avlsskalaen på 5.8 millioner purker og 110 millioner griser10,11. Rapporten fra Animal and Plant Health Inspection Service viser at 49,8 % av uvaksinerte griser viser tilstedeværelse av PRRSV i serum12 og lave nivåer av PRRSV hos infiserte griser skilles ut gjennom spytt, nesesekret, urin og avføring13. Flere strategier er implementert for å kontrollere PRRSV-forplantning 14,15,16. I tillegg til eliminasjonsprosedyrer for å skape fullstendig virusnegative populasjoner eller forbedre biosikkerhet og håndtering, er administrering av vaksiner et effektivt middel for å kontrollere PRRS.
PRRSV er et innkapslet, enkelttrådet RNA-virus med positiv sans med en lengde på omtrent 15 kilobaser (kb). PRRSV-genomet består av minst 10 åpne leserammer (ORF), en kort 5′ uoversatt region (5′ UTR) og en poly(A) hale ved 3′-terminalen (figur 1A)17. Genomet til et negativt trådet RNA-virus er ikke-smittsomt, mens genomet fra positivtrådede RNA-virus er smittsomt. Det er to hovedstrategier for RNA- og DNA-transfeksjon for å generere virusavkom18. Kloning av fragmentet i full lengde som tilsvarer RNA-genomet er imidlertid avgjørende for konstruksjonen av smittsomme kloner. På grunn av den lange og komplekse naturen til PRRSV-genomet, kan genomet i full lengde ikke lett oppnås gjennom PCR på en gang. I tillegg, selv om den kunstige syntesen av PRRSV-gener er en effektiv løsning, er syntesen av lange fragmenter ofte dyr. Derfor, for å oppnå PRRSV-ekspresjonsvektoren i full lengde, forsøkte vi å lage den ved hjelp av den homologe rekombinasjonsmetoden19,20 med flere innsatser. Dessverre klarte vi ikke å få tak i genekspresjonsvektoren i full lengde. Derfor, i denne studien, la vi til passende restriksjonssteder til den omvendte primeren og oppnådde pVAX1-PRRSV-ekspresjonsvektoren ved flere runder med homologe rekombinasjonsreaksjoner. Videre kan denne metoden også oppnå sletting eller mutasjon av målgener og effektivt koble et stort antall DNA-fragmenter til ekspresjonsvektoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gibson-monteringsteknikken er en in vitro rekombinasjonsbasert molekylær kloningsmetode for montering av DNA-fragmenter8. Denne metoden muliggjør montering av flere DNA-fragmenter til et sirkulært plasmid i en isotermisk reaksjon med ett rør. En av hindringene for Gibson Assembly-teknikken er imidlertid anskaffelsen av lange fragmenter fra cDNA. De lange fragmentene er vanskelige å forsterke nøyaktig av mange grunner. For eksempel er primere lettere å mismatche i lange forlengelses…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av økonomisk støtte fra doktorgradsforskningsinitieringsmidlene gitt av China West Normal University (nr. 20E059).
Materials
| 1 kb plus DNA Ladder | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
| 2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
| Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
| Clean Bench | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
| DNA Electrophoresis Equipment | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
| DNA Loading Buffer (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
| E. Z. N. A. Gel Extraction kit | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
| E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
| Electro-heating Standing-temperature Cultivator | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
| ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
| ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
| FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
| FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
| FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
| FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
| Goldview Nucleic Acid Gel Stain | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
| Ice Maker Machine | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
| Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
| LB Agar Plate (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
| LB sterile liquid medium (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
| Micropipettors | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
| Microwave Oven | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
| Orbital Shakers | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
| PRRSV virus | Sichuan Agricultural University | — | |
| SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | To design primers |
| T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
| TAE buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA extraction reagent |
References
- Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
- Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55 (2007).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
- Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
- Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500 (2020).
- Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45 (2012).
- Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
- Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
- Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
- Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
- Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
- Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
- Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
- Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
- Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720 (2022).
- Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410 (2011).
- Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).
