Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.
Die meisten lebenden Organismen besitzen zirkadiane Rhythmen, d. h. biologische Prozesse, die innerhalb eines Zeitraums von etwa 24 Stunden ablaufen und ein vielfältiges Repertoire an zellulären und physiologischen Prozessen regulieren, die vom Schlaf-Wach-Rhythmus bis zum Stoffwechsel reichen. Dieser Uhrmechanismus zieht den Organismus auf der Grundlage von Umweltveränderungen mit und koordiniert die zeitliche Regulation molekularer und physiologischer Ereignisse. Zuvor wurde gezeigt, dass autonome zirkadiane Rhythmen auch auf Einzelzellebene aufrechterhalten werden, indem Zelllinien wie NIH3T3-Fibroblasten verwendet werden, die maßgeblich an der Aufdeckung der Mechanismen des zirkadianen Rhythmus beteiligt waren. Bei diesen Zelllinien handelt es sich jedoch um homogene Kulturen, denen es an Vielzelligkeit und robuster interzellulärer Kommunikation mangelt. In den letzten zehn Jahren wurden umfangreiche Arbeiten zur Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung von 3D-Organoiden durchgeführt, bei denen es sich um in vitro multizelluläre Systeme handelt, die in vivo morphologischen Strukturen und Funktionen ähneln. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Detektion zirkadianer Rhythmen mit Hilfe eines biolumineszierenden Reporters in humanen intestinalen Enteroiden beschrieben, das die Untersuchung zirkadianer Rhythmen in multizellulären Systemen in vitro ermöglicht.
Zirkadiane Uhr
Alle Organismen, von Bakterien bis zu Säugetieren, haben eine komplexe und dynamische Beziehung zu ihrer Umwelt. Innerhalb dieser Beziehung ist die Anpassung an Umweltveränderungen entscheidend für das Überleben von Organismen. Die meisten Organismen verfügen über zirkadiane Rhythmen, die es ihnen ermöglichen, sich an Tageszyklen von etwa 24 Stunden anzupassen und ihre Funktionen zu optimieren. Die zirkadiane Uhr ist ein hierarchisches Netzwerk aus zentralen und peripheren Uhren, die zusammenarbeiten, um die physiologische Homöostase aufrechtzuerhalten und den Organismus mit den täglichen Veränderungen synchron zu halten 1,2. Bei Säugetieren empfängt die Zentral- oder Hauptuhr im suprachiasmatischen Kern (SCN) externe Signale wie Licht und leitet die Informationen über ein fortschrittliches Zusammenspiel von neuronalen und humoralen Signalwegen an die peripheren Uhrenweiter 3. Zusätzlich zur zentralen Uhr verfügen periphere Gewebe über einen eigenen zellautonomen zirkadianen Uhrmechanismus, der durch eine transkriptionell-translationale negative Rückkopplungsschleife (TTFL) aufrechterhalten wird, die gewebespezifische uhrgesteuerte Gene (CCGs) reguliert4,5. Diese molekulare Maschinerie erzeugt eine Rhythmizität von etwa 24 Stunden bei zellulären und physiologischen Ereignissen, wie z. B. Genexpressionen, Signalwegen, Immunantworten und Verdauung. Die zirkadiane Uhr ist in fast allen Säugetierzellen vorhanden, und es wurde gezeigt, dass bis zu 50 % der Expressionsmuster der Gene eine zirkadiane Rhythmizität aufweisen6. In Anbetracht der Fülle an CCGs kann eine Störung dieses Uhrwerks zu kritischen physiologischen Problemen führen. Daher sind Untersuchungen des zirkadianen Rhythmus notwendig, um wesentliche biologische Mechanismen aufzuklären und neue therapeutische Strategien zu entwickeln.
Luziferase-Reportersystem
In zirkadianen Studien ist die Echtzeitüberwachung entscheidend für ein besseres Verständnis zellulärer Verhaltensweisen und Reaktionen, da sie die Verfolgung zeitlicher Veränderungen der Genexpression und/oder des Proteinspiegels ermöglicht und Einblicke in die molekularen Mechanismen liefert, die von der zirkadianen Uhr reguliert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Echtzeitüberwachung den Forschern, die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf molekulare Mechanismen zu untersuchen 7,8. Es gibt zahlreiche Techniken für Echtzeit-Überwachungsstudien, einschließlich des Biolumineszenz-Assays, der häufig zur Verfolgung der Genexpression oder des Proteinspiegels im Laufe der Zeit verwendet wird. Der Biolumineszenz-Assay ist eine Methode zum Nachweis biologischer Prozesse unter Verwendung der Lichterzeugung als Auslese. In diesem Assay wird ein oxidatives Enzym, das Biolumineszenz erzeugt (z. B. Luciferase), entweder vorübergehend oder stabil in die interessierenden Zellen transfiziert, und die Biolumineszenzauslesung wird in Gegenwart eines Substrats (z. B. Luciferin) über die Zeit gemessen. Zum Beispiel erzeugt das Luciferase-Enzym Biolumineszenz, indem es das Substrat Luciferin in Gegenwart von ATP9 oxidiert. Aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit von 3-4 h10 ist die Glühwürmchen-Luziferase ein leistungsstarkes Werkzeug für zirkadiane Studien, da sie eine dynamische Echtzeitüberwachung mit minimalem Hintergrundrauschen ermöglicht 11,12,13. Für die Insertion von DNA mit einem Luciferase-markierten Promotor oder Open Reading Frame (ORF) ist das lentivirale Gen-Delivery-System eine zuverlässige Methode, die eine hohe Transduktionswirksamkeit, eine stabile Integration und eine geringe Immunogenität bietet. Die stabile Transduktion eines biolumineszenten Reporters sorgt für eine robuste Expression in sich teilenden und nicht teilenden Zellen und liefert konsistente Daten für zirkadiane Studien14.
Organoid als Modell
Traditionelle immortalisierte zweidimensionale Zelllinien waren maßgeblich an biologischen Studien beteiligt, die von der Aufdeckung grundlegender molekularer Mechanismen des zirkadianen Rhythmus bis hin zum Wirkstoffscreening reichen. Trotz der Bequemlichkeit, homogenisierte Zelllinien zu verwenden, fehlen ihnen multizelluläre Strukturen und interzelluläre Interaktionen. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei Organoiden um multizelluläre “organähnliche” In-vitro-3D-Strukturen, die die Organstruktur in einer Schale nachahmen, indem sie Ähnlichkeit mit der in vivo-Gewebearchitektur und Vielzelligkeit aufweisen, einschließlich Stamm-, Vorläufer- und differenzierten Zelltypen15,16. Der Besitz von Selbstorganisation, Vielzelligkeit und Funktionalität macht Organoide zu einem bemerkenswerten In-vitro-Modell, das die zellulären und physiologischen Prozesse darstellt, die in realen Geweben ablaufen17. Verschiedene Arten von Organoiden können aus pluripotenten Stammzellen durch gerichtete Differenzierung oder adulten Stammzellen gewonnen werden, die aus verschiedenen Organen, einschließlich Dünndarm, Gehirn, Leber, Lunge und Niere entnommen werden,18,19. Da organoide Strukturen eine echte gewebeähnliche Architektur besitzen und mit Vielzelligkeit und dynamischer Zell-zu-Zell-Interaktion funktionieren, sind sie homogenisierten Zelllinien überlegen, um die zellulären Ereignisse in in vivo-Geweben zu verstehen. Organoide sind außerdem leicht zu manipulieren und können unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet werden, was sie für zirkadiane Studien nützlich macht20.
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Einführung einer Echtzeit-Überwachungsmethode unter Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, der speziell auf die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus in multizellulären 3D-Organoiden zugeschnitten ist. Die Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse mit einer Biolumineszenz-Assay-Technik wurde häufig für Zellkulturen durchgeführt, denen die multizelluläre Komplexität und interzelluläre Kommunikation fehlt, die in echtem Gewebe vorhanden sind. 3D-Organoide bieten einzigartige Möglichkeiten, die Funktionen des zirkadianen Rhythmus in multizellulären Systemen in vitro zu untersuchen. Man könnte zum Beispiel zirkadiane Rhythmen in den Organoiden mit veränderten Zellzusammensetzungen oder Organoiden untersuchen, die aus erkranktem Gewebe von Patienten stammen. Dieses Protokoll ermöglicht die Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, um verschiedene Aspekte des zirkadianen Rhythmus in einem physiologisch relevanteren In-vitro-Modell , Organoiden, zu untersuchen, was uns helfen wird, die Rolle des zirkadianen Rhythmus in peripheren Organen besser zu verstehen.
Der Biolumineszenz-Assay bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus, was eine Datenerhebung aus Langzeit-Zeitverlaufsexperimenten erfordert. Erstens ermöglicht es Forschern, die Genexpression oder das Protein von Interesse zu überwachen, während sich Zellen bewegen und vermehren. Ohne unnötige Anpassungen vorzunehmen oder die Zellfunktionen zu stören, können interessierte zelluläre Ereignisse oder die Genexpression mithilfe der Biolumineszenzauslesung aufgezeichnet werden, die zuverläs…
The authors have nothing to disclose.
Die humanen Darmenteroide wurden aus dem Labor von Dr. Michael Helmrath am Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) gewonnen. Diese Arbeit wurde von R01 DK11005 (CIH) und der Pilotfinanzierung des University of Cincinnati Cancer Center unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung durch die Bildgebung durch das Live Microscopy Core der University of Cincinnati (NIH S10OD030402).
35 x 10 Falcon tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | |
A 83-01 | Sigma Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-028 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-829-1Bb | Mfrn: BD 329424 |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | GSK-3 inhibitor |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902-500MG | |
D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | |
Gastrin I Human | Sigma Aldrich | G9020 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel | Corning | CB-40230C | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stemcell Technologies | 06010 | Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium |
Kronos Dio Luminometer Machine | ATTO Corporation | AB-2550 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165 | |
pABpuro-BluF reporter plasmid | Addgene | 46824 | |
PBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Recombinant murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
Y-27632 | R&D Systems | 1254/10 | ROCK inhibitor |