تلفيق القنوات ميكروفلويديك الحراري

Summary

نحن هنا لشرح كيفية صنع رقائق ميكروفلويديك بالحرارة باستخدام النقش الساخنة والختم الحرارة. ثم نحن لشرح كيفية استخدام السطح في ضوء توجه ترقيع الوضع الطبيعي والبلمرة من خلال رقاقة مختومة لتشكيل مركب الأعمدة المرحلة الصلبة.

Abstract

في المختبر ، وقد نجحنا في عزل الأحماض النووية مباشرة من وحدات التخزين وميكروليتر submicroliter الإنسان البول والدم والبراز باستخدام البوليمر / جسيمات متناهية الصغر تحلل الميكروسكيل المركبة واستخراج الأعمدة الصلبة المرحلة. عينات تعافى تتركز ، وعينات صغيرة الحجم التي PCRable ، من دون أي تنظيف إضافية. هنا ، ونحن لشرح كيفية تصنيع رقائق ميكروفلويديك بالحرارة باستخدام النقش الساخنة والختم الحرارة. ثم ، نحن لشرح كيفية استخدام السطح في ضوء توجه ترقيع الوضع الطبيعي والبلمرة من خلال رقاقة مختومة لتشكيل مركب الأعمدة المرحلة الصلبة. نظهر ترقيع والبلمرة عمود أنابيب / مركب البوليمر الكربون لتحلل الخلايا البكتيرية. ثم نعرض عملية تحلل تليها مرحلة الاستخراج صلبة من الأحماض النووية من العينة على الشريحة باستخدام السيليكا / عمود مركب البوليمر. البروتوكولات المرفقة تحتوي على تعليمات مفصلة حول كيفية جعل كل من تحلل والأعمدة الصلبة استخراج المرحلة.

Protocol

هي ملفقة القنوات ميكروفلويديك في دوري البولي (Zeonex ® 690R ، Zeon الكيميائية المحدودة ، لويزفيل ، كنتاكي). Zeonex لديه درجة حرارة التحول الزجاجي (T _ز) من 136 درجة مئوية ، والأشعة فوق البنفسجية شفافة ، وهو أمر ضروري للكيمياء الخفيفة الموجهة المستخدمة في تشكيل متراصة التي يسهل اختراقها. هي ملفقة من قبل microchannels الدقيقة النقش الساخنة مع قالب رئيسية كهربي نيكو ، التي لديها سلبية (معكوس) ملامح منصة ميكروفلويديك. ويتم ذلك في النقش على الساخن على النحو التالي :

1. يتم وضع القالب والركيزة البوليمر بين اثنين من المعادن platens موازية.
2. يتم تسخين platens يصل إلى درجة حرارة النقش (166 درجة مئوية) ، والتي هي 30 درجة مئوية فوق _جي تي من Zeonex.
3. ثم يتم ضغط platens معا لحوالي 5 دقائق والمحافظة على ضغط 250 رطل في البوصة المربعة.
4. ثم تتم إزالة العفن والركيزة لمن platens ساخنة ، تترك لتبرد لمدة 1-2 دقيقة ، ثم فصلها عن بعضها البعض يدويا.
5. يتم حفر الآبار من 1.5 ملم قطر في نهايات القنوات لإدخال العينة وجمع.
6. ثم هو الركيزة البلاستيك تنقش المستعبدين حراريا مع قطعة أخرى من Zeonex لتشكيل قنوات ميكروفلويديك المغلقة. يمكن الركيزة تنقش وقطعة تغطي يكون للأشعة فوق البنفسجية أو الأوزون البلازما معاملة حرارية قبل الرابطة لتعزيز كفاءة وختم ضمان الدقة للهيكل قناة المغلقة (باتاشاريا وKlapperich ، 2007).

تصنيع الصلب المرحلة العمود (SPE) استخراج داخل القنوات ميكروفلويديك البلاستيك

تلفيق المرحلة الصلبة هي عملية من خطوتين. في البداية ، وmicrochannels ملفقة وتعديل السطح من أجل تحسين الالتصاق من العمود SPE إلى الجهاز من البلاستيك. بلمرة ضوئية المنشأ عبر ترقيع سطح يستخدم لfunctionalize أسوار microchannels البوليمرية.

إجراء عمليات ترقيع على النحو التالي :

1. تمتلئ microchannels بمزيج من diacrylate 01:01 الإيثيلين (EDA) وميتاكريليت الميثيل (MMA) مع benzophenone 3 ٪ ، وهو استخلاص الهيدروجين photoinitiator. يتم شراؤها ، وجمعية الإمارات للغوص ، ومجلس العمل المتحد benzophenone من سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO.
2. الشريحة ومن ثم المشع للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة في الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر و 200 ميغا جول / سم ² للطاقة في صك التعرض الأشعة فوق البنفسجية (CL - 1000 Crosslinker الأشعة فوق البنفسجية ، UPV شركة ، المرتفعات ، كاليفورنيا). ويحدث عن طريق تطعيم H - التجريد البلمرة والنتائج في سلاسل البوليمر سطح المربوطة ، والتي أدرجت ضمن الحصول على خليط البلمرة تستخدم لإعداد متراصة في الخطوة الثانية.
3. تتم إزالة مونومر الزائدة من القنوات التي الشطف مع 15 ميكرولتر من الميثانول باستخدام الشفط.

بعد عملية photografting ، يتم تشكيل البوليمر microporous متراصة داخل microchannels أن إيقاع جسيمات السيليكا لاستخراج الحمض النووي. مستعدة متراصة مسامية في الموقع على النحو التالي :

1. تمتلئ القنوات السطحية تعديل بمزيج السلائف متراصة مؤلفة من فاعل (15 ٪ بالوزن) ، ادما (10 ٪ بالوزن) ، 1 - dodecanol (52.5 ٪ بالوزن) ، سيكلوهيكسانول (22.5 ٪ بالوزن) ، DMPAP (1 ٪ بالوزن مع الاحترام لمونومرات) ، و 0.7 ميكرومتر جسيمات السيليكا (15 ٪ بالنسبة لإجمالي حجم الخليط قبل البوليمر). تم شراء المجهرية من السيليكا Polysciences ، وشركة (وارينغتون ، والسلطة الفلسطينية) ويتم شراؤها من مونومرات والمذيبات porogenic من سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO.
2. غير المشع في الشريحة مع الأشعة فوق البنفسجية في crosslinker فوق البنفسجية على 200 ميغا جول / سم ² مقابل 1.1 دقيقة على بدء البلمرة ، ويتم إزالة مونومر الزائدة من القنوات التي الشطف مع 15 ميكرولتر من الميثانول باستخدام الشفط.
3. وترد ثم fluidic اتصالات (اتصالات NanoPorts ^TM ، أبتشيرتش العلمية ، اوك هاربور ، واشنطن) على مقدمة وآبار جمع من القنوات ميكروفلويديك.
4. ثم يتم غسل متراصة مسامية مرة أخرى مع الميثانول لا يقل عن 30 دقيقة باستخدام مضخة الحقن بمعدل تدفق 100mL/hour.

تلفيق CNT تحلل متراصة داخل القنوات ميكروفلويديك البلاستيك

تلفيق للتحلل المركز الوطني للاستشعار متراصة (أنابيب الكربون) هي عملية من خطوتين. أولا ، يتم تعديل microchannels ملفقة السطحية (المطعمة) بالطريقة نفسها بالنسبة للأعمدة SPE في الجهاز من البلاستيك.

بعد عملية photografting ، يتم تشكيل البوليمر microporous متراصة داخل متناهية التي يتم مشربة الأنابيب النانومترية الكربونية متعددة الجدران. مستعدة متراصة مسامية في الموقع على النحو التالي :

1. ومعلق متعددة الجدران أنابيب في سيكلوهيكسانول بتركيز 2.27M. هذا هو ultrasonicated إعادة تعليق لمدة 30 دقيقة في سعة 50 ٪ و 50 ٪ لدورة العمل مع خلية disruptor sonifier (Sonifier S - 250D ، المصنعة من قبل برانسون بالموجات فوق الصوتية ، دانبري ، ط م). قدمت صوتنة لتعليق فعال ومستقر من 0.5M تشارك المركز الوطني. تم شراء تشارك المركز الوطني من Nanolabs (برايتون ، MA).
2. تمتلئ القنوات السطحية تعديل بمزيج مماثلة السلائف متراصة إلا أنه الآن في حل سيكلوهيكسانول + يستخدم تشارك المركز الوطني. الخليط متراصة تتألف من فاعل (15 ٪ بالوزن) ، ادما (10 ٪ بالوزن) ، 1 - dodecanol (52.5 ٪ بالوزن) ، وتشارك المركز الوطني سيكلوهيكسانول + (22.5 ٪ بالوزن). لهذا الحل واضاف DMPAP photoinitiator (1.13 ٪ فيما يتعلق بالوزن مونومرات). يتم شراؤها من مونومرات والمذيبات وporogenic DMPAPA من سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO.
3. غير المشع في الشريحة مع الأشعة فوق البنفسجية في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية في ² ميغا جول / 120 سم عن 0،9 دقيقة لبدء البلمرة. هو انعكاس الجهاز 180 درجة في crossliker والمشع لآخر دقيقة في 120 ميغا جول 0.9 / سم ^2. تتم إزالة مونومر الزائدة من القنوات التي الشطف مع 50 ميكرولتر من الميثانول باستخدام الشفط.
4. وترد ثم fluidic اتصالات (اتصالات NanoPorts ^TM ، أبتشيرتش العلمية ، اوك هاربور ، واشنطن) على مقدمة وآبار جمع من القنوات ميكروفلويديك.

البكتيرية إعداد نموذج للاستخدام مع المركز الوطني للاستشعار تحلل متراصة

إعداد نموذج لعينة جرثومية ينطوي على اتخاذ قياس الكثافة البصرية في ل 600Nm للتأكد من أن العينة ليست مركزة للغاية وذلك لتفادي انسداد القناة.

1. أخذ القراءة في التطوير التنظيمي ل 600Nm مع البكتيريا في وسائل الإعلام ، ويتم ذلك مع مقياس التكيف للظلام (إيبندورف مقياس التكيف للظلام ، إيبندورف العلمية المحدودة ، ويستبري ، نيويورك). تمييع العينة حتى قراءات OD تقع ضمن نطاق 0،18-0،25 A.
2. العينة في جهاز الطرد المركزي 6500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، وسكب وطاف.

تحلل

1. البكتيريا Resuspend في GuSCN * + 0.01 ٪ + 4 ٪ SDS بروتيناز K (0.8mg/ml). دوامة لفترة وجيزة (1ml من البكتيريا في وسائل الإعلام ينبغي أن يكون معلق في GuSCN 1ml). وأضيف بروتين كاف في حل للمساعدة في تغيير طبيعة البروتينات التي تعلق على الحمض النووي البكتيرية ويمنع DNAases وRNAases. فائدة إضافية للبروتين K هو أنه يساعد أيضا مع تحطيم البروتينات الخلوية الجدار الذي أمر مرغوب فيه لأن كلا من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام جدران الخلايا البكتيريا تحتوي على كميات كبيرة من البروتين (على الرغم من الجراثيم سلبية الغرام وعادة ما يكون المزيد من البروتين ). وبالإضافة إلى المساعدات chaotropic العازلة للبروتين كاف مع تغيير طبيعة البروتينات في حين أن المنظفات يعطل جدار الخلية. اشتريت بروتين كاف وثيوسيانات guanidinium (GuSCN) من شركة Qiagen (فالنسيا ، كاليفورنيا). تم شراؤها SDS (كبريتات الصوديوم دوديسيل) من بيرس (روكفورد ، إلينوي).
2. تحميل فورا العينة في حقنة متصلة أنابيب PEEK. نضح المحقنة بحيث لا الهواء في النظام. توصيل أنابيب للnanoport والقناة.

تم استخدام مضخة الحقن KDS100 (المصنعة من قبل العلم دينار كويتي ، Holliston ، MA) لتجارب ومعدل تدفق المستخدمة هي 450 ميكرولتر / ساعة لكافة الخطوات. تدفق القناة تحلل العينات في 450ul/hr.

1. جمع العينة ، والشروع في استخراج الحمض النووي عن طريق جمعية مهندسي البترول (انظر استخراج الحمض النووي البروتوكول). ملاحظة : هذه عينة جرثومية لن تحتاج لمتابعة تحميل الخطوة 2 ، حيث يتم تعليق GuSCN *.

استخراج الحمض النووي البروتوكول

إجراءات استخراج تتكون من 3 خطوات :

1. تحميل.
2. بواشنطن.
3. أزل.

تم استخدام مضخة KDS100 حقنة (المصنعة من قبل العلم دينار كويتي ، Holliston ، MA) لتجارب ومعدل التدفق كان يستخدم 300 ميكرولتر / ساعة لكافة الخطوات.

حمولة

1. حالة القناة مع العازلة chaotropic (GuSCN ^* ، guanidinium ثيوسيانات) لمدة 1-2 دقيقة قبل بدء التجربة.
2. مزيج العينة مع العازلة chaotropic في نسبة 1:1.
3. تدفق خليط عينة عن طريق القناة لمدة 3 دقائق.

غسل

1. غسل القناة مع الإيثانول 70 ٪ لمدة 2 دقيقة.
2. غسل القناة مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 2 دقيقة.

أزل

1. أزل الحمض النووي المستخرج من المياه لمدة 3 دقائق ميليبور. جمع 15 ميكرولتر من المنقى ، PCR جاهزة الحمض النووي.

* تم استخدام GuSCN من عدة Qiagen (الاحتياطي RLT).