열가 소성 Microfluidic 채널 제작

Summary

여기 핫 엠보싱 및 열 실링을 사용하여 열가 소성 microfluidic 칩을를 조작하는 방법을 보여줍니다. 그럼 우리가 합성 고체 위상 열을 형성 밀봉된 칩을 통해 현장 조명 감독 접목 표면 중합에 사용하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

우리가 실험실에서, 우리는 성공적으로 직접 폴리머 / nanoparticle 합성 microscale 용해와 고체 상 추출 컬럼을 사용하여 인간의 혈액, 소변 및 대변의 microliter과 submicroliter 볼륨에서 핵산을 격리합니다. 회수 샘플 추가 정리없이 PCRable 아르 집중, 소량의 샘플입니다. 여기서 우리는 핫 엠보싱 및 열 실링을 사용하여 열가 소성 microfluidic 칩을를 조작하는 방법을 보여줍니다. 그렇다면, 우리는 합성 고체 위상 열을 형성 밀봉된 칩을 통해 현장 조명 감독 접목 표면 중합에 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 접목과 세균 세포의 용해를위한 탄소 나노튜브 / 고분자 복합 열 중합 보여줍니다. 그렇다면 우리는 실리카 / 폴리머 복합 컬럼을 사용하여 칩 샘플로부터 핵산의 견고한 위상 추출 다음에 용해 과정을 보여줍니다. 첨부 프로토콜은 용해와 고체 상 추출 컬럼을 모두 만드는 방법에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

Protocol

microfluidic 채널 순환 폴리올레핀 (Zeonex ® 690R, Zeon 화학 주식 회사, 루이빌, KY)에 가공하고 있습니다. Zeonex는 다공성 모놀 형성에 사용되는 조명 감독 화학에 필수적인 어떤, 136 ° C의 유리 전이 온도 (T _g)를 보유하고 투명 UV 있습니다. microchannels은 microfluidic 플랫폼의 부정 (반전) 기능을 가진 니코 electroformed 마스터 - 곰팡이와 마이크로 핫 엠보싱으로 가공하고 있습니다. 핫 엠보싱은 다음과 같이 이루어집니다 :

1. 몰드 및 고분자 기판은 두 병렬 금속 platens 사이에 위치하고 있습니다.
2. platens는 Zeonex의 T _g 이상 30 º C입니다 엠보싱 온도 (166 ° C)까지 가열합니다.
3. platens 그런 다음 약 5 분 함께 누르면되고 압력은 최대 250 PSI에서 관리하고 있습니다.
4. 몰드와 기판은 다음 1-2 분 냉각 허용 가열 platens에서 제거하고 수동으로 서로 구분됩니다.
5. 1.5 mm 직경의 웰스는 샘플 소개 및 수집 채널의 끝에 뚫고있다.
6. 양각 플라스틱 기판은 다음 열 동봉된 microfluidic 채널을 형성 Zeonex의 다른 조각와 결합됩니다. 양각 기판과 커버 조각은 UV - 오존 또는 씰링 효율을 향상시키고 동봉된 채널 구조 (Bhattacharyya 및 Klapperich, 2007)의 충실도를 보장하기 전에 열 본딩을 처리 플라즈마 수 있습니다.

플라스틱 microfluidic 채널에서 고체 상 추출 (SPE) 칼럼의 제작

고체 단계의 제작은 두 단계로 이루어집니다. 처음에는 가공 microchannels은 플라스틱 장치 SPE 열의 접착력을 향상시키기 위해 표면을 수정합니다. 표면 photopolymerization 통해 이식하는 것은 고분자 microchannels의 벽을 functionalize하는 데 사용됩니다.

다음과 같이 접목 과정은 다음과 같습니다 :

1. microchannels은 수소 초록 photoinitiator됩니다 3 % benzophenone와 에틸렌 diacrylate (EDA) 및 메틸 메타 크릴 레이트 (MMA)의 1:1 혼합으로 가득합니다. EDA, MMA와 benzophenone는 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO에서 구입한 있습니다.
2. 칩은 자외선 노출기구 (CL - 1000 자외선 Crosslinker, UPV 주식 회사, 업랜드, CA)에서 254 nm의 UV 파장 200 MJ / cm ^2의 에너지 10 분 후 UV - 조사입니다. 접목은 두번째 단계에서 모놀의 준비에 사용되는 중합 혼합물 내에 통합 얻을 표면 닿는 고분자 사슬에 H - 추출 중합 및 결과를 통해 발생합니다.
3. 초과 단량체는 진공 열망​​을 사용하여 메탄올 15 μL와 rinsing하여 채널에서 제거됩니다.

photografting 과정 후, microporous 고분자 모놀은 microchannels 내에 형성되는 DNA 추출에 대한 모함 실리카는 입자. 다음과 같이 다공성 모놀리스는 원래의 장소에 준비가되어 있습니다 :

1. 표면으로 바뀌었 채널 BuMA (15 % WT), EDMA (10 % WT), 1 - dodecanol (52.5 % WT), cyclohexanol (22.5 % WT), DMPAP 구성된 모놀 전구체 혼합물과 관련하여 (1 % WT로 채워집니다 단량체)와 0.7 μm의 실리카 입자 (사전 폴리머 혼합물의 전체 볼륨에 대하여 15 %)합니다. 실리카 microspheres는 Polysciences 주식 회사 (워링턴, PA)에서 구입한 및 단량체와 porogenic 용제는 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO에서 구입한 있습니다.
2. 이 칩은 중합을 시작 1.1 분 200 MJ / cm ² UV crosslinker에서 UV로 조사하고, 초과 모노머는 진공 열망을 사용하여 메탄올 15 μL와 rinsing하여 채널에서 제거됩니다.
3. 유체 연결 (NanoPorts ^TM 연결 업처치 과학, 오크 하버, WA) 다음 microfluidic 채널의 도입 및 수집 우물에 첨부됩니다.
4. 다공성 모놀은 다음 100mL/hour의 유량에서 주사기 펌프를 사용하여 적어도 30 분 메탄올로 다시 세탁 있습니다.

플라스틱 microfluidic 채널에서 CNT 용해 모놀의 제작

CNT (탄소 나노튜브) 용해 모놀의 제작은 두 단계로 이루어집니다. 먼저, 가공 microchannels은 플라스틱 장치에서 SPE 열에 대한 것과 동일한 방식으로 표면에 수정 (이식할)입니다.

photografting 과정 후, microporous 고분자 모놀은 다중 벽의 탄소 나노튜브를 임신되는 microchannel 내에 형성됩니다. 다음과 같이 다공성 모놀리스는 원래의 장소에 준비가되어 있습니다 :

1. 다중 벽으로 둘러싸인 나노튜브는 2.27M의 농도에 cyclohexanol에 resuspended 있습니다. 이 resuspension는 50 %의 진폭에서 30 분 ultrasonicated 및 sonifier 세포 방해 (함께 50 %의 듀티 사이클이다 Sonifier S - 250초음파 브랜슨, 단베리, CT)에 의해 제조 D. sonication은 CNTs의 효율적이고 안정적​​인 0.5M 정지를 제공했습니다. CNTs는 Nanolabs (브라이튼, MA)에서 구입했다.
2. 표면 수정된 채널 이제 cyclohexanol의 솔루션 + CNTs를 사용 제외하고 유사한 모놀 전구체 혼합물로 채워지게된다. 모놀리스 혼합물은 BuMA (15 % WT), EDMA (10 % WT), 1 - dodecanol (52.5 % WT), 그리고 cyclohexanol + CNTs (22.5 %의 WT)로 구성되어 있습니다. 이 솔루션에 photoinitiator의 DMPAP는 (단량체에 대하여 WT 1.13 %)이 추가됩니다. 단량체, porogenic 솔벤트와 DMPAPA는 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO에서 구입한 있습니다.
3. 이 칩은 중합을 시작하는 데 0.9 분 120 MJ / cm ² UV crosslinker의 UV와 함께 조사합니다. 장치는 crossliker에서 180도 뒤집힌 120 MJ / cm ² 또 다른 0.9 분 조사입니다. 초과 단량체는 진공 열망​​을 사용하여 메탄올 50 μL와 rinsing하여 채널에서 제거됩니다.
4. 유체 연결 (NanoPorts ^TM 연결 업처치 과학, 오크 하버, WA) 다음 microfluidic 채널의 도입 및 수집 우물에 첨부됩니다.

CNT 용해 모놀리스와 함께 사용하기위한 세균 샘플 준비

박테리아 샘플에 대한 샘플 준비 채널을 막히는 것을 피하기 위해 샘플이 매우 너무 집중되지 않도록 600nm에서 광학 밀도 측정을 복용 포함됩니다.

1. 미디어 박테리아와 600nm에서 OD 읽기를 가지고, 이것은 biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf 과학 주식 회사, 베리, NY)으로 이루어집니다. OD의 수치가 범위 0.18-0.25 A. 이내에 가을까지 샘플을 희석
2. 5 분 6,500 RPM에서 샘플을 원심과 뜨는을 가만히 따르다.

용해

1. GuSCN에 Resuspend 박테리아 * + 0.01 % SDS + 4% Proteinase K (0.8mg/ml). 소용돌이 간단히 (미디어에서 박테리아의 1ml 1ml GuSCN에 resuspended해야합니다.) Proteinase K는 세균의 DNA에 붙어 있으며 DNAases 및 RNAases을 억제하는 단백질을 denaturing와 원조에 대한 해결책에 추가되었습니다. proteinase K의 추가적인 장점은 또한 그람 음성 세균은 일반적으로 더 많은 단백질을 가지고 있지만, 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균의 세포 벽 모두 단백질의 대량 (포함되기 때문에 바람직 세포 벽의 단백질을 무너 뜨와 에이즈는 것입니다 ). chaotropic 버퍼 또한 세제는 세포 벽을 방해하면서 단백질 denaturing와 proteinase K를 에이즈. Proteinase K와 guanidinium thiocyanate의 (GuSCN)은 Qiagen 주식 회사 (발렌시아, CA)에서 구입했다. SDS는 (나트륨 Dodecyl의 황산) 피어스 (록퍼드, IL)에서 구입했습니다.
2. 즉시 피크 튜브에 연결된 주사기에 샘플을로드합니다. 더 공기가 시스템에 없다는 것을 때문에 주사기 대기음. nanoport 및 채널에 튜브를 연결합니다.

KDS100 주사기 펌프는 (KD 과학, 홀리스튼, MA 제조) 실험에 사용되며 사용되는 유량은 모든 단계에 450 μL / 시간가되었습니다. 450ul/hr에서 샘플 용해 채널을 흐름.

1. 샘플을 수집하고 SPE를 통해 DNA 추출 (DNA 추출 프로토콜을 참조)을 참조하십시오. 참고 : 정지가 GuSCN 있기 때문에이 박테리아 샘플,로드 2 단계를 수행하지 않아도됩니다 *.

DNA 추출 프로토콜

추출 절차는 3 단계로 구성되어 있습니다 :

1. 로드합니다.
2. 워시
3. Elute.

KDS100 주사기 펌프는 (KD 과학, 홀리스튼, MA 제조) 실험에 사용되며 사용되는 유량은 300 μL / 모든 단계에 대한 시간이었습니다.

하중

1. 실험을 시작하기 전에 1-2 분 chaotropic 버퍼와 채널 (GuSCN ^* guanidinium thiocyanate) 조건.
2. 1시 1분 비율로 chaotropic 버퍼로 샘플을 섞는다.
3. 3 분위한 채널을 통해 흐름 샘플 혼합합니다.

빨래

1. 2 분 70 %의 에탄올로 채널을 씻으십시오.
2. 2 분 100 %의 에탄올로 채널을 씻으십시오.

Elute

1. 3 분위한 millipore 물에 추출한 DNA를 Elute. 정화의 15 μL, PCR - 준비 DNA를 수집합니다.

* Qiagen 키트 (버퍼 RLT)에서 GuSCN가 사용되었습니다.