Summary
在这里我们将演示如何制造热塑性微流体芯片采用热压成型和热封。然后，我们将演示如何使用通过密封芯片执导的原位光接枝表面和聚合，形成的复合材料的固相柱。
Abstract
在我们的实验室，我们已经成功地分离出核酸，直接从人体的血液，尿液和大便使用聚合物/纳米粒子复合材料的微观溶解和固相萃取柱微升和submicroliter卷。回收的样本PCRable无需任何额外的清理，集中，小体积样品。在这里，我们将演示如何制造热塑性微流体芯片采用热压成型和热封。然后，我们将演示如何使用通过密封芯片执导的原位光接枝表面和聚合，形成的复合材料的固相柱。我们展示嫁接和碳纳米管/聚合物复合列细菌细胞裂解聚合。然后，我们显示芯片采用硅/聚合物复合材料柱从样品核酸的固相萃取的裂解过程。所附的协议包含如何使裂解和固相萃取柱的详细说明。
Protocol
制造微流体通道在一个循环的聚烯烃（Zeonex ® 690R，吉恩化工有限公司，路易斯维尔，肯塔基州）。 Zeonex有136℃的玻璃化转变温度（Tg）和紫外线透明的，这是光在巨石形成多孔的用于化学至关重要。微结构微热压印一个尼科电铸主模，它具有负（反）微流体平台的功能。热压印完成如下：
- 模具和聚合物衬底之间放置两个平行的金属压板。
- 该压板加热压花温度（166℃）， 这是30 º C以上的Zeonex 的 Tg。
- 的压板，然后同时按下约5分钟，并保持在250磅的压力。
- 模具与基板，然后取出从加热盘，让其冷却1-2分钟，然后手动相互分离。
- 1.5毫米直径的井钻探样品的引进和收集渠道的两端。
- 压纹塑料基板，然后用另一块的Zeonex热粘合，形成封闭的微流体通道。浮雕基材和覆盖件可紫外臭氧或热粘合前处理，以提高密封效率和确保封闭的渠道结构（巴塔和Klapperich，2007年）的保真度的等离子体。
塑料微流体通道内固相萃取（SPE）柱的制备
固相制备是一个两步的过程。起初，编造微表面改性的塑料装置，以提高固相萃取柱的附着力。通过表面聚合接枝是用于功能化的聚合物微通道的墙壁。
嫁接过程如下：
- 微充满了1:1的混合物的环氧丙烯酸酯（EDA）和甲基丙烯酸甲酯（MMA）用3％的二苯甲酮，这是一个抽象的光引发剂的氢。 EDA，甲基丙烯酸甲酯和二苯甲酮均购自Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州。
- 然后，该芯片是紫外线照射，在254 nm紫外线波长和紫外线照射仪（CL - 1000紫外交联剂，UPV公司，高地，加州）200兆焦耳 /厘米2的能量为10分钟。嫁接发生拴表面的聚合物链，获得的庞然大物在第二步准备使用的聚合混合物中通过的H -抽象的聚合和结果。
- 从通道中删除多余的单体与15μL甲醇使用真空抽吸冲洗。
后接枝过程中，微孔聚合物巨石形成的微通道内，坑害二氧化硅粒子对DNA的提取。 多孔的一块准备在原地如下：
- 表面改性的通道都充满了一个庞然大物的易制毒化学布玛（15％WT），EDMA（10％WT），1 - 十二醇（52.5％WT），环己醇（22.5％WT），DMPAP组成的混合物（1％WT与尊重单体）和0.7微米的二氧化硅微粒（尊重的预聚物的混合物总量的15％）。硅胶微球均购自Polysciences，公司（睡眠PA）和Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州购买的单体和porogenic溶剂。
- 该芯片是与紫外线紫外线交联剂照射在200兆焦耳/厘米2为1.1分引发聚合，从通道中删除多余的单体与15μL甲醇使用真空抽吸冲洗。
- （NanoPorts TM连接，厄普丘奇科学，橡树港，WA）流体连接，然后附着在微流体通道的引进和集水井。
- 多孔的一块，然后再与甲醇洗涤使用注射泵流量的100mL/hour至少30分钟。
北海裂解一枝独秀制作塑料微流体通道内
制备的CNT（碳纳米管）裂解庞然大物是一个两步的过程。首先，制造微表面改性（嫁接），在同样的方式在塑料设备的SPE柱。
后接枝过程中，形成微孔聚合物一枝独秀内的多壁碳纳米管浸渍微。 多孔的一块准备在原地如下：
- 多壁碳纳米管悬浮在环己醇在2.27M的浓度。这再悬浮超声在50％幅度为30分钟和一个sonifier细胞干扰物（50％占空比Sonifier的S - 250丹伯里，必能信超声，CT）的研发，制造的。超声提供了碳纳米管的有效和稳定的0.5M的悬浮液。 Nanolabs（布赖顿，马萨诸塞州）均购自碳纳米管。
- 除了现在的环己醇的解决方案+使用碳纳米管是表面改性通道都充满了类似的巨石前体的混合物。一枝独秀的混合物组成的布玛（15％WT），EDMA（10％WT），1 - 十二醇（52.5％WT），环己醇+碳纳米管（22.5％WT）。此解决方案添加光引发剂DMPAP（1.13％的单体重量）。单体，porogenic溶剂和DMPAPA均购自Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州。
- 该芯片是在120兆焦耳/ 厘米 2照射紫外线紫外线交联剂为0.9分钟，引发聚合。该设备是180度翻转的crossliker，另一个在120兆焦耳/平方厘米0.9分钟照射。从通道中删除多余的单体与50μL甲醇使用真空抽吸冲洗。
- （NanoPorts TM连接，厄普丘奇科学，橡树港，WA）流体连接，然后附着在微流体通道的引进和集水井。
北海裂解一枝独秀使用的细菌样品制备
一种细菌样品的样品制备涉及到在600nm处的光密度测量，以确保该样本是不是非常集中，以免堵塞通道。
- 在与媒体的细菌600nm处的OD读数，这是一个分光光度计（Eppendorf公司分光光度计，科学的Eppendorf公司，韦斯特伯里，纽约州）。稀释样品，直到OD值下降的范围内0.18-0.25答：
- 在5分钟6500转离心样品，倒出上清液。
裂解
- GuSCN悬浮细菌* + .01％SDS + 4％，蛋白酶K（0.8mg/ml）。涡简要（媒体细菌1毫升应悬浮1毫升GuSCN）。蛋白酶K被添加到解决方案援助变性，附着细菌的DNA和蛋白质抑制DNAases和RNAases。蛋白酶K的一个额外的好处是，它也打破细胞壁的蛋白质，这是可取的，因为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中含有大量的蛋白质（虽然革兰氏阴性菌通常有更多的蛋白质艾滋病）。此外，离液剂缓冲区艾滋病的蛋白酶K与变性的蛋白质，而洗涤剂破坏细胞壁。蛋白酶K和胍硫氰酸盐（GuSCN）均购自Qiagen公司（瓦伦西亚，加利福尼亚州）。 SDS（十二烷基硫酸钠）购自皮尔斯（罗克福德，IL）。
- PEEK管连接到一个注射器，立即装入样品。使系统在没有空气吸入注射器。连接管nanoport和渠道。
一个KDS100注射泵（Holliston，马KD科学，制造）用于实验和使用的流量为450μL/小时的所有步骤。流450ul/hr样品裂解通道。
- 收集样品，并继续通过SPE提取DNA（DNA提取协议）。注意：这种细菌样本不会需要遵循载荷步2，自暂停GuSCN *.
DNA的提取协议
提取过程包括3个步骤：
- 负载。
- 华盛顿州
- 流出。
KDS100注射泵（Holliston，马KD科学，制造）用于实验和使用的流量为300μL/小时的所有步骤。
负载
- 条件通道离液剂缓冲区（GuSCN *，硫氰酸胍）在实验开始前1-2分钟。
- 在离液剂缓冲液按1:1的比例混合样品。
- 3分钟的通道流过样品的混合物。
洗
- 洗2分钟与70％乙醇的通道。
- 洗净与100％乙醇2分钟的渠道。
洗脱
- 3分钟的微孔水洗脱提取的DNA。收集15μL纯化，DNA PCR准备。
* GuSCN从Qiagen公司试剂盒（缓冲区RLT）。
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References
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices. Lab Chip. 7, 876-882 (2007).
