熱可塑性マイクロ流体チャネルの作製

Summary

ここでは、ホットエンボス加工とヒートシールを使用して熱可塑性マイクロ流体チップを作製する方法を示します。その後、我々は、複合固相カラムを形成するために密封されたチップを介してその場の光監督接ぎ木面や重合で使用する方法を示します。

Abstract

私たちの研究室では、我々が正常に直接ポリマー/ナノ粒子複合材料のマイクロ溶解し、固相抽出カラムを用いて、ヒト血液、尿や便のマイクロリットルとsubmicroliterボリュームから核酸を単離した。回収したサンプルは、追加のクリーンアップを行わず、PCRableな集中、少量のサンプルです。ここでは、ホットエンボス加工とヒートシールを使用して熱可塑性マイクロ流体チップを作製する方法を示します。その後、我々は複合固相カラムを形成するために密封されたチップを介してその場の光監督接ぎ木面や重合で使用する方法を示します。私たちは、細菌の細胞溶解のために移植し、カーボンナノチューブ/ポリマー複合列の重合を実証。私たちは、その後、シリカ/ポリマー複合カラムを用いてチップ上のサンプルからの核酸の固相抽出に続いて溶解処理を示しています。添付のプロトコールは、溶解し、固相抽出カラムの両方を作成する方法に関する詳細な指示が含まれています。

Protocol

マイクロ流体チャネルは、環状ポリオレフィン（ゼオネックス® 690R、ゼオンケミカル（株）、ルイビル、ケンタッキー州）で製造されています。ゼオネックスは、多孔質モノリスの形成に使用される光の指示化学に不可欠である、136 ° Cのガラス転移温度（T _g）を持ち、透明なUVです。マイクロチャネルは、マイクロ流体プラットフォームの負の（逆）機能を持っているニコ電鋳マスターモールドとのマイクロホットエンボス加工によって製造される。ホットエンボス加工は、次のとおり行われます。

1. 金型およびポリマー基板は、2つの平行な金属のプラテンの間に配置されています。
2. プラテンは、ゼオネックスの_T gを上記の30 º Cであるエンボス加工温度（166℃）、まで加熱されています。
3. プラテンは、その後約5分間一緒に押され、圧力は250 psiで維持されます。
4. モールドと基板は、その後1〜2分のために冷却し、加熱されたプラテンから削除し、手動で互いに分離される。
5. 1.5 mm径の井戸は、サンプル導入および収集のためのチャネルの両端で掘削されています。
6. エンボス加工プラスチック基板は、熱的に同封のマイクロ流体チャネルを形成するために、ゼオネックスの別の部分で接着されている。エンボス加工基板とカバー部分は、UV -オゾンやシール効率を向上させ、密閉チャネル構造（はなはだとKlapperich、2007）の再現性を保証するために、前に熱接合にプラズマ処理することができます。

プラスチック製マイクロ流体チャネル内の固相抽出（SPE）カラムの作製

固相の作製は、2段階のプロセスです。最初は、製造されたマイクロチャネルは、プラスチック製のデバイスにSPEカラムの密着性を向上させるために表面修飾される。表面の光重合を経由してグラフト重合する高分子マイクロチャネルの壁を官能化するために使用されます。

移植の手順は以下の通りです：

1. マイクロチャネルは、水素抽象化する光開始剤である3％のベンゾフェノン、とエチレンジアクリレート（EDA）とメチルメタクリレート（MMA）の1:1混合物で充填される。 EDA、MMA及びベンゾフェノンはSigma - Aldrich、セントルイス、MOから購入されています。
2. チップは、紫外線露光器（CL - 1000 UV架橋剤、UPV社、アップランド、カリフォルニア州）で254 nmの紫外波長と200ミリジュール/ cm ^2のエネルギーで10分間後、UV照射です。接ぎ木は、H -抽象化重合と第二段階におけるモノリスの調製に用いられる重合混合物内に取り込まなくては表面テザーポリマー鎖、の結果を介して行われます。
3. 過剰のモノマーを真空吸引を使用して、メタノールの15μLを洗浄することによりチャネルから削除されます。

グラフトプロセスの後、微孔質ポリマーモノリスは、DNAの抽出のための捕捉シリカ粒子そのマイクロチャネル内に形成される。 多孔質モノリスは、以下のように その場で調製されています。

1. 表面改質されたチャンネルはBuMA（15重量％）、EDMA（10％重量）、1 - ドデカノール（52.5重量％）、シクロヘキサノール（22.5重量％）、DMPAPから成るモノリス前駆体の混合物に関して、（1重量％で充填される単量体）と0.7μmのシリカ粒子（プレポリマー混合物の合計量に対して15％）まで。 MO、セントルイス、シリカ微小球はPolysciences社（ウォリントン、PA）から購入し、モノマーとporogenic溶剤はSigma - Aldrichから購入されています。
2. チップは、重合を開始、1.1分、200ミリジュール/ cm ²でUVクロスリンカーでUVを照射され、そして過剰のモノマーを真空吸引を使用して、メタノールの15μLを洗浄することによりチャネルから削除されます。
3. 流体接続（NanoPorts ^TM接続、アップチャーチ科学、オークハーバー、ワシントン州）は、その後、マイクロ流体チャネルの導入と収集井戸の上に貼付されています。
4. 多孔質モノリスは、100mL/hourの流量でシリンジポンプを使用して少なくとも30分間、メタノールで再び洗浄した。

プラスチック製マイクロ流体チャネル内のCNT溶解モノリスの作製

CNT（カーボンナノチューブ）溶解モノリスの作製は、2段階のプロセスです。最初に、作製したマイクロチャネルは、プラスチック製のデバイスでのSPEカラムの場合と同じ方法で表面改質（接木）です。

グラフトプロセスの後、微孔質ポリマーモノリスは、多層カーボンナノチューブを含浸されるマイクロチャネル内に形成される。 多孔質モノリスは、以下のように その場で調製されています。

1. 多層ナノチューブは、2.27Mの濃度でシクロヘキサノールに再懸濁する。この再懸濁は、超音波処理細胞内分泌かく乱（超音波処理S - 250と振幅の50％と50％のデューティサイクルで30分間超音波処理され超音波ブランソン、ダンベリー、コネチカット州）製D、。超音波処理は、CNTの効果的かつ安定した0.5Mサスペンションを提供した。 CNTはNanolabs（ブライトン、MA）から購入した。
2. 表面改質されたチャネルは、シクロヘキサノールのその今のソリューション+ CNTが使用されているを除いて同様のモノリス前駆体の混合物で充填される。モノリスの混合物はBuMA（15重量％）、EDMA（10％重量）、1 - ドデカノール（52.5重量％）、およびシクロヘキサノール+カーボンナノチューブ（22.5重量％）で構成されています。この溶液に、光開始剤のDMPAPは（モノマーに対して重量1.13パーセント）が追加されます。モノマー、porogenic溶剤とDMPAPAはSigma - Aldrich、セントルイス、MOから購入されています。
3. チップは、重合を開始するために0.9分、120ミリジュール/ cm ²でUVクロスリンカーでUVを照射する。デバイスはcrosslikerで180度反転、120 MJ / cm ²の別の0.9分間照射する。過剰のモノマーを真空吸引を使用してメタノール50μLで洗浄することによりチャネルから削除されます。
4. 流体接続（NanoPorts ^TM接続、アップチャーチ科学、オークハーバー、ワシントン州）は、その後、マイクロ流体チャネルの導入と収集井戸の上に貼付されています。

CNT溶解モノリスで使用するための細菌サンプルの調製

細菌のサンプル用のサンプル調製には、チャネルの目詰まりを避けるために、サンプルが極端にそう集中されていないことを確認するために600nmの光学濃度の測定を行う伴います。

1. メディアの中の細菌と600nmの時のODの読み値を取得、これは暗順応計（エッペンドルフ暗順応計、エッペンドルフサイエンティフィック社、ウェストベリー、ニューヨーク州）で行われます。 ODの測定値が範囲0.18〜0.25 Aの内に収まるまで、サンプルを希釈する
2. 5分間6500 rpmでサンプルを遠心し、上清をデカントする。

溶解

1. GuSCN * + 0.01パーセントSDS + 4％プロテイナーゼK（0.8mg/ml）で再懸濁します細菌。軽くボルテックスして（メディアの中の細菌1mlの1ミリリットルGuSCNに再懸濁しする必要があります）。プロテイナーゼKは、細菌のDNAに接続されているとDNAasesとRNAasesを抑制するタンパク質を変性を支援するために溶液に添加した。プロテイナーゼKの別の利点は、それはまた、グラム陰性細菌は、通常より多くのタンパク質を持っているものの、グラム陽性菌およびグラム陰性細菌の細胞壁の両方がタンパク質を大量に（含まれているため、望ましい細胞壁のタンパク質を分解することで助けることです。 ）。カオトロピックバッファは、さらに界面活性剤は細胞壁を破壊しながらタンパク質を変性とプロテイナーゼKを助けます。プロテイナーゼKとグアニジンチオシアネート（GuSCN）はキアゲン社（バレンシア、カリフォルニア州）から購入した。 SDSは、（ドデシル硫酸ナトリウム）ピアース（ロックフォード、IL）から購入した。
2. すぐにPEEKチューブに接続してシリンジでサンプルをロードする。空気がシステムに存在しないようにシリンジを吸引除去する。 nanoportとチャネルにチューブを接続します。

KDS100シリンジポンプ（KDサイエンティフィック、ホリストン、MA社製）を実験に使用され、使用される流量は、すべてのステップを450μL/時間ですされました。 450ul/hrでのサンプル溶解のチャネルを流れる。

1. サンプルを収集し、SPEを経由してDNAの抽出（DNA抽出プロトコールを参照）に進みます。注意：懸濁液をGuSCNされているため、この細菌のサンプルは、負荷ステップ2を実行する必要はありません*

DNA抽出プロトコル

抽出操作は3ステップで構成されています：

1. 負荷。
2. ワシントン州
3. 溶出。

KDS100シリンジポンプ（KDサイエンティフィック、ホリストン、MA社製）を実験に使用され、使用される流量は、すべてのステップのための300μL/時間であった。

負荷

1. 条件の実験を開始する前に1〜2分間カオトロピックバッファ（GuSCN ^*、グアニジニウムチオシアネート）を使用してチャネル。
2. 1:1の比率でカオトロピックバッファーでサンプルを混ぜる。
3. 3分間チャネルを介してフローサンプルの混合物。

洗う

1. 2分間70％エタノールを使用してチャネルを洗ってください。
2. 2分間100％エタノールを使用してチャネルを洗ってください。

溶出する

1. 3分間ミリポア水で抽出したDNAを溶出する。精製、PCR用DNAの15μLを収集する。

*キアゲンのキット（バッファRLT）からGuSCNが使用されました。