Fabbricazione dei canali termoplastico Microfluidic

Summary

Qui mostriamo come fabbricare chip microfluidici termoplastico con goffratura a caldo e saldatura a caldo. Poi ci dimostrano come l'uso in superficie chiara situ l'innesto diretto e la polimerizzazione attraverso il chip sigillati a formare le colonne composte in fase solida.

Abstract

Nel nostro laboratorio, abbiamo isolato con successo gli acidi nucleici direttamente dai volumi e submicroliter microlitri di sangue umano, urine e feci con polimero / nanoparticelle lisi composito microscala e solide colonne di estrazione di fase. I campioni recuperati sono concentrati, i campioni di piccolo volume che sono PCRable, senza alcuna pulizia supplementare. Qui, dimostriamo come fabbricare chip termoplastico microfluidica con goffratura a caldo e saldatura a caldo. Poi, ci dimostrano come l'uso in superficie chiara situ l'innesto diretto e la polimerizzazione attraverso il chip sigillati a formare le colonne composte in fase solida. Dimostriamo innesto e polimerizzazione di una colonna di nanotubi di carbonio / polimero composito per lisi cellulare batterica. Poi mostrano il processo di lisi seguita da estrazione in fase solida degli acidi nucleici dal campione sul chip di silicio con un / colonna polimero composito. I protocolli allegati contengono istruzioni dettagliate su come fare sia lisi e colonne di estrazione in fase solida.

Protocol

I canali microfluidica sono fabbricati in poliolefine ciclico (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY). Zeonex ha una temperatura di transizione vetrosa _(Tg) di 136 ° C ed è trasparente ai raggi UV, che è essenziale per la chimica luce diretta utilizzato nella formazione porosa monolite. I microcanali sono realizzati da micro-hot-embossing con Nico elettroformati master-stampo, che è il negativo (inverso) caratteristiche della piattaforma microfluidica. Il caldo, goffratura è fatto come segue:

1. Lo stampo e il substrato polimerico sono posti tra due piastre metalliche parallele.
2. Le piastre vengono riscaldate fino alla temperatura di rilievo (166 ° C), che è di 30 º C al di sopra della T _g di Zeonex.
3. Le piastre vengono premuti insieme per circa 5 min e la pressione è mantenuta a 250 psi.
4. Lo stampo e il substrato vengono poi rimossi dai piani riscaldati, lasciato raffreddare per 1-2 minuti, e poi manualmente separati l'uno dall'altro.
5. Pozzi di 1,5 mm di diametro sono forati alle estremità dei canali per l'introduzione del campione e la raccolta.
6. Il substrato di plastica in rilievo è poi termosaldata con un altro pezzo di Zeonex al modulo allegato canali microfluidica. Il substrato in rilievo e il pezzo di copertura può essere UV-ozono o plasma trattati prima dell'incollaggio termico per migliorare l'efficienza di tenuta e garantire la fedeltà della struttura del canale chiuso (Bhattacharyya e Klapperich, 2007).

Fabbricazione di estrazione in fase solida (SPE) colonna all'interno dei canali di plastica microfluidica

Realizzazione della fase solida è un processo in due fasi. In un primo momento, i microcanali fabbricato sono superficie modificata in modo da migliorare l'adesione della colonna SPE al dispositivo in plastica. L'innesto tramite fotopolimerizzazione superficie viene utilizzato per funzionalizzare le pareti della microcanali polimerici.

La procedura di innesto è la seguente:

1. I microcanali sono riempite con una miscela 1:1 di diacrilato etilene (EDA) e metil metacrilato (MMA) con 3% benzofenone, che è un fotoiniziatore idrogeno astrazione. L', EDA MMA e benzofenone sono acquistati da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. Il chip viene poi UV irradiata per 10 minuti a 254 nm di lunghezza d'onda UV e 200 mJ / cm ² di energia in uno strumento esposizione ai raggi ultravioletti (CL-1000 Crosslinker UV, UPV Inc., Ontario, CA). L'innesto avviene attraverso H-astrazione polimerizzazione e dei risultati in superficie legato catene di polimeri, che vengono inseriti all'interno di polimerizzazione la miscela utilizzata per la preparazione del monolite nel secondo passaggio.
3. Il monomero in eccesso viene rimosso dai canali di risciacquo con 15 ml di metanolo con l'aspirazione a vuoto.

Dopo il processo di photografting, un polimero microporoso monolite è costituito all'interno della microcanali che intrappolano le particelle di silice per l'estrazione del DNA. Il monolite poroso viene preparato in situ come segue:

1. I canali superficie modificata sono riempite con una miscela precursore monolite composto da Buma (15% in peso), EDMA (10% in peso), 1-dodecanolo (52,5% in peso), cicloesanolo (22,5% in peso), DMPAP (peso 1% rispetto di monomeri) e 0,7 micron particelle di silice (15% rispetto al volume totale del pre-polimero misto). Le microsfere di silice sono stati acquistati da Polysciences, Inc. (Warrington, PA) ed i monomeri e solventi porogenic sono acquistati da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. Il chip viene irradiato con raggi UV nel reticolante UV a 200 mJ / cm ² per 1.1 minuti per iniziare la polimerizzazione, e il monomero in eccesso viene rimosso dai canali di risciacquo con 15 ml di metanolo con l'aspirazione a vuoto.
3. I collegamenti fluidica (NanoPorts connessioni ^TM, Upchurch scientifico, Oak Harbor, WA) sono poi attaccati l'introduzione e pozzetti di raccolta dei canali microfluidica.
4. Il monolite poroso viene poi lavato di nuovo con il metanolo per almeno 30 minuti utilizzando la pompa a siringa con un flusso di 100mL/hour.

Fabbricazione di CNT lisi monolite all'interno dei canali di plastica microfluidica

Realizzazione della (nanotubi di carbonio) lisi monolite CNT è un processo in due fasi. In primo luogo, i microcanali fabbricato sono superficie modificata (innestata) nello stesso modo come per le colonne SPE nel dispositivo di plastica.

Dopo il processo di photografting, un monolite microporoso polimero si forma all'interno del microcanali che è impregnato di multi-parete nanotubi di carbonio. Il monolite poroso viene preparato in situ come segue:

1. Multi-nanotubi a parete sono risospesi in cicloesanolo ad una concentrazione di 2.27M. Questo risospensione è ultrasonicated per 30 minuti al 50% di ampiezza e duty cycle del 50% con una cella sonifier distruttore (Sonifier S-250D, prodotto da ultrasuoni Branson, Danbury, CT). La sonicazione fornito una sospensione efficace e stabile 0.5M di CNT. I nanotubi di carbonio sono stati acquistati da Nanolabs (Brighton, MA).
2. I canali superficie modificata sono riempiti con una miscela simile precursore monolite solo che adesso la soluzione di cicloesanolo + CNT viene utilizzato. La miscela monolite è costituito da Buma (15% in peso), EDMA (10% in peso), 1-dodecanolo (52,5% in peso), e cicloesanolo + nanotubi di carbonio (22,5% in peso). Per questa soluzione il DMPAP fotoiniziatore viene aggiunto (1,13% in peso rispetto ai monomeri). I monomeri, solventi e porogenic DMPAPA sono acquistati da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
3. Il chip viene irradiato con raggi UV nel reticolante UV a 120 mJ / cm ² per 0,9 minuti per iniziare la polimerizzazione. Il dispositivo viene capovolto di 180 gradi in crossliker e irradiati per un altro min 0,9 a 120 mJ / cm ^2. Il monomero in eccesso viene rimosso dai canali di risciacquo con 50 ml di metanolo con l'aspirazione a vuoto.
4. I collegamenti fluidica (NanoPorts connessioni ^TM, Upchurch scientifico, Oak Harbor, WA) sono poi attaccati l'introduzione e pozzetti di raccolta dei canali microfluidica.

Preparazione del campione batterico per l'uso con CNT lisi monolito

La preparazione del campione per un campione batterica consiste nel prelievo di una misurazione della densità ottica a 600nm per garantire che il campione non è estremamente concentrata in modo da evitare di intasare il canale.

1. Prendete una lettura OD a 600nm con i batteri in media, questo è fatto con un BioPhotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY). Diluire il campione fino a quando le letture OD rientrano nell'intervallo 0,18-0,25 A.
2. Centrifugare il campione a 6.500 giri per 5 minuti e decantare il surnatante.

Lisi

1. Batteri risospendere in GuSCN * + 0,01% SDS + 4% proteinasi K (0.8mg/ml). Vortex brevemente (1 ml di batteri in media dovrebbero essere risospeso in 1ml GuSCN). Proteinasi K è stato aggiunto alla soluzione di un aiuto con denaturazione delle proteine ​​che sono attaccati al DNA batterico e di inibire DNAases e RNAases. Un ulteriore vantaggio della proteinasi K è che si aiuta anche con la rottura verso il basso le proteine ​​della parete cellulare, che è auspicabile in quanto entrambi i batteri gram-positivi e gram-negativi pareti cellulari dei batteri contengono grandi quantità di proteine ​​(anche se i batteri gram-negativi hanno in genere più proteine ). Il buffer caotropico aiuti ulteriormente la proteinasi K con denaturazione delle proteine, mentre il detergente rompe la parete cellulare. Proteinasi K e tiocianato guanidinio (GuSCN) sono stati acquistati da Qiagen Inc. (Valencia, CA). SDS (Dodecyl solfato di sodio) è stato acquistato da Pierce (Rockford, IL).
2. Immediatamente carico il campione in una siringa collegata al tubo di PEEK. Aspirare la siringa in modo che l'aria non è nel sistema. Collegare il tubo alla nanoport e canale.

Una pompa a siringa KDS100 (prodotto da KD scientifico, Holliston, MA) è stato utilizzato per gli esperimenti e la portata utilizzata è di 450 microlitri / ora per tutti i passaggi. Flusso del canale lisi campione a 450ul/hr.

1. Raccogliere il campione e procedere con l'estrazione del DNA tramite SPE (vedi protocollo di estrazione del DNA). Nota: questo esempio batteri non avrà bisogno di seguire passo carico 2, dal momento che la sospensione è GuSCN *.

Protocollo di estrazione del DNA

La procedura di estrazione è costituito da 3 fasi:

1. Carico.
2. Washington
3. Eluire.

Pompa a siringa KDS100 (prodotto da KD scientifico, Holliston, MA) è stato utilizzato per gli esperimenti e la portata è stato utilizzato 300 ml / h per tutti i passaggi.

Carico

1. Condizione il canale con il tampone caotropico (GuSCN ^*, guanidinio tiocianato) per 1-2 minuti prima di iniziare l'esperimento.
2. Mescolare il campione con il tampone caotropico in rapporto 1:1.
3. Flusso di miscela campione attraverso il canale per 3 min.

Lavare

1. Lavare il canale con etanolo al 70% per 2 minuti.
2. Lavare il canale con il 100% di etanolo per 2 min.

Eluire

1. Eluire il DNA estratto in acqua Millipore per 3 min. Raccogliere 15 ml di purificato, PCR-ready DNA.

* Il GuSCN dal kit Qiagen (buffer RLT) è stato utilizzato.