La fabrication des canaux microfluidiques thermoplastique

Summary

Ici, nous montrer comment fabriquer des puces microfluidiques thermoplastiques en utilisant gaufrage à chaud et l'étanchéité de la chaleur. Ensuite, nous montrent comment utiliser la lumière à la surface in situ réalisé la greffe et la polymérisation à travers la puce scellée pour former des colonnes composites en phase solide.

Abstract

Dans notre laboratoire, nous avons réussi à isoler les acides nucléiques directement à partir de micro-volumes et submicroliter de sang, d'urine et de selles humaines en utilisant un polymère / nanoparticules composites micro-lyse et solide colonnes d'extraction en phase. Les échantillons récupérés sont concentrés, des échantillons de faible volume qui sont PCRable, sans aucun nettoyage supplémentaire. Ici, nous montrons comment fabriquer les puces microfluidiques thermoplastiques à l'aide de gaufrage à chaud et l'étanchéité de la chaleur. Ensuite, nous montrent comment utiliser la lumière à la surface in situ réalisé la greffe et la polymérisation à travers la puce scellée pour former des colonnes composites en phase solide. Nous démontrons le greffage et la polymérisation d'un nanotube de carbone / polymère colonne composite pour la lyse des cellules bactériennes. Nous montrons ensuite le processus de lyse suivie par extraction en phase solide des acides nucléiques de l'échantillon sur la puce en utilisant une silice / polymère colonne composite. Les protocoles joints contiennent des instructions détaillées sur la façon de faire à la fois la lyse et l'extraction en phase solide colonnes.

Protocol

Les canaux microfluidiques sont fabriquées dans une polyoléfine cyclique (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc, Louisville, KY). Zeonex a une température de transition vitreuse _(Tg) de 136 ° C et est transparente aux UV, ce qui est essentiel pour la chimie lumière dirigée utilisé dans la formation poreuse monolithe. Les microcanaux sont fabriqués par des micro-gaufrage à chaud avec un maître-NiCo électroformés moule qui a la borne négative (inverse) caractéristiques de la plate-forme microfluidique. Le gaufrage à chaud se fait comme suit:

1. Le moule et le substrat polymère sont placées entre deux plaques métalliques parallèles.
2. Les plateaux sont chauffés jusqu'à la température de gaufrage (166 ° C), ce qui est de 30 º C au-dessus du T _g de Zeonex.
3. Les plateaux sont ensuite pressées pendant environ 5 min et la pression est maintenue à 250 psi.
4. Le moule et le substrat sont ensuite retirés des plateaux chauffés, on laisse refroidir pendant 1-2 min, puis manuellement séparés les uns des autres.
5. Des puits de 1,5 mm de diamètre sont percés aux extrémités des canaux pour l'introduction de l'échantillon et la collecte.
6. Le substrat en plastique gaufré est alors thermoliés avec un autre morceau de Zeonex au formulaire ci-joint canaux microfluidiques. Le substrat en relief et la pièce de couverture peut être UV-ozone ou plasma traité avant le collage thermique pour améliorer l'efficacité de l'étanchéité et s'assurer de la fidélité de la structure du canal fermé (Bhattacharyya et Klapperich, 2007).

Fabrication d'extraction en phase solide (SPE) de colonne dans les canaux microfluidiques en plastique

La fabrication de la phase solide est un processus en deux étapes. Au début, les microcanaux sont fabriqués à surface modifiée afin d'améliorer l'adhérence de la colonne SPE à l'appareil en plastique. Greffage via photopolymérisation de surface est utilisée pour fonctionnaliser les murs des microcanaux polymériques.

La procédure de greffage est comme suit:

1. Les microcanaux sont remplis d'un mélange 1:1 de diacrylate d'éthylène (AED) et le méthacrylate de méthyle (MMA) avec de la benzophénone 3%, ce qui est un photo-initiateur d'hydrogène abstraire. L'AED, MMA et la benzophénone sont achetés chez Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. La puce est ensuite irradiée aux UV pendant 10 min à 254 nm de longueur d'onde UV et 200 mJ / cm ² d'énergie dans un instrument exposition aux ultraviolets (CL-1000 Crosslinker UV, UPV Inc, Upland, CA). Le greffage se fait par H-abstraction de polymérisation et les résultats dans des chaînes de polymère en surface captif, qui se incorporé dans le mélange de polymérisation utilisé pour la préparation du monolithe dans la deuxième étape.
3. Le monomère en excès est éliminé par les voies d'un rinçage avec 15 uL de méthanol en utilisant une aspiration.

Après le processus de photografting, un polymère microporeux monolithe est formé dans les microcanaux qui piège les particules de silice pour l'extraction de l'ADN. Le monolithe poreux est préparé in situ comme suit:

1. Les canaux à surface modifiée sont remplis d'un mélange précurseur monolithe composé de BuMA (15% en poids), l'EDMA (10% en poids), le 1-dodécanol (52,5% en poids), le cyclohexanol (22,5% en poids), DTSC (1% en poids par rapport aux monomères) et 0,7 um des particules de silice (15% par rapport au volume total du mélange de pré-polymère). Les microsphères de silice ont été achetés auprès de Polysciences, Inc (Warrington, PA) et les monomères et les solvants porogène sont achetés auprès de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
2. La puce est irradié par UV dans le réticulant UV à 200 mJ / cm ² pour les 1,1 min pour initier la polymérisation, et le monomère en excès est éliminé par les voies d'un rinçage avec 15 uL de méthanol en utilisant une aspiration.
3. Les connexions fluidiques (NanoPorts connexions ^MC, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) sont ensuite attachés à l'introduction et les puits de collecte des canaux microfluidiques.
4. Le monolithe poreux est ensuite lavé à nouveau avec du méthanol pendant au moins 30 min en utilisant la pompe à seringue à un débit de 100mL/hour.

La fabrication des CNT lyse monolithe dans les canaux microfluidiques en plastique

Fabrication de la CNT de lyse (nanotubes de carbone) monolithe est un processus en deux étapes. Tout d'abord, les microcanaux sont fabriqués à surface modifiée (greffé) de la même manière que pour les colonnes SPE dans le dispositif en plastique.

Après le processus de photografting, un polymère microporeux monolithe est formé au sein du microcanal qui est imprégné de nanotubes de carbone multi-parois. Le monolithe poreux est préparé in situ comme suit:

1. Nanotubes à parois multiples sont remis en suspension dans du cyclohexanol à une concentration de 2.27M. Cette remise en suspension est ultrasons pendant 30 minutes à une amplitude de 50% et 50% de cycle avec une cellule sonificateur perturbateur (Sonifier S-250D, fabriqué par ultrasons Branson, Danbury, CT). La sonication a fourni une suspension effective et stable 0.5M de NTC. Les NTC ont été achetés auprès Nanolabs (Brighton, MA).
2. Les canaux à surface modifiée sont remplies d'un mélange précurseur de monolithe similaire, sauf que maintenant la solution du cyclohexanol + NTC est utilisé. Le mélange se compose de monolithe BuMA (15% en poids), l'EDMA (10% en poids), le 1-dodécanol (52,5% en poids), et le cyclohexanol + NTC (22,5% en poids). Pour cette solution, le DTSC photoinitiateur est ajouté (1,13% en poids par rapport aux monomères). Les monomères, solvants porogène et DMPAPA sont achetés chez Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
3. La puce est irradié par UV dans le réticulant UV à 120 mJ / cm ² pour les 0,9 min pour initier la polymérisation. L'appareil est retourné à 180 degrés dans le crossliker et irradié pour un autre 0,9 min à 120 mJ / cm ^2. Le monomère en excès est éliminé par les voies d'un rinçage avec 50 ul de méthanol en utilisant une aspiration.
4. Les connexions fluidiques (NanoPorts connexions ^MC, Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) sont ensuite attachés à l'introduction et les puits de collecte des canaux microfluidiques.

Préparation des échantillons bactériens pour une utilisation avec la CNT lyse monolithe

La préparation des échantillons pour un échantillon bactérien consiste à prendre une mesure de densité optique à 600 nm afin de s'assurer que l'échantillon n'est pas très concentrée de manière à éviter l'encrassement du canal.

1. Prenez une lecture de DO à 600nm avec la bactérie dans les médias, cela se fait avec une BioPhotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc, Westbury, NY). Diluer l'échantillon jusqu'à ce que la lecture OD tombent dans la fourchette de 0,18 à 0,25 A.
2. Centrifuger l'échantillon à 6500 rpm pendant 5 minutes et décanter le surnageant.

Lyse

1. Remettre en suspension dans les bactéries GuSCN * + 0,01% SDS + 4% protéinase K (0.8mg/ml). Brièvement au vortex (1ml de bactéries dans les médias doivent être remises en suspension dans 1ml GuSCN). Protéinase K a été ajouté à la solution à l'aide avec dénaturation des protéines qui sont attachées à l'ADN bactérien et d'inhiber DNAases et RNAases. Un avantage supplémentaire de la protéinase K est que cela aide aussi à briser les protéines de la paroi cellulaire qui est souhaitable car les deux bactéries gram-positives et gram-négatives murs bactéries cellules contiennent de grandes quantités de protéines (bien que les bactéries Gram négatif ont généralement plus de protéines ). Le tampon chaotrope aides outre, la protéinase K avec dénaturation des protéines tandis que les détergents perturbe la paroi cellulaire. Protéinase K et de thiocyanate de guanidinium (GuSCN) ont été achetés auprès de Qiagen Inc (Valencia, CA). SDS (dodécyl sulfate de sodium) a été acheté auprès de Pierce (Rockford, IL).
2. Immédiatement charge de l'échantillon dans une seringue reliée à un tuyau en PEEK. Aspirer la seringue afin que l'air n'est pas dans le système. Branchez le tuyau à la nanoport et le canal.

Une pompe à seringue KDS100 (fabriqué par KD Scientific, Holliston, MA) a été utilisée pour les expériences et le débit utilisé est de 450 ul / heure pour toutes les étapes. Débit du canal lyse de l'échantillon au 450ul/hr.

1. Recueillir l'échantillon et de procéder à l'extraction de l'ADN par l'intermédiaire de SPE (voir protocole d'extraction d'ADN). Remarque: Cet exemple bactérienne pas besoin de suivre l'étape 2 de charge, depuis la suspension est GuSCN *.

Protocole d'extraction d'ADN

La procédure d'extraction se compose de 3 étapes:

1. Charger.
2. Wash
3. Éluer.

Seringue KDS100 (fabriqué par KD Scientific, Holliston, MA) a été utilisée pour les expériences et le débit utilisé est de 300 ul / heure pour toutes les étapes.

Charge

1. Condition du canal avec le tampon chaotrope (GuSCN ^*, thiocyanate de guanidinium) pendant 1-2 min avant de commencer l'expérience.
2. Mélanger l'échantillon avec le tampon chaotrope dans le rapport 1:1.
3. Écoulement du mélange de l'échantillon à travers le canal pendant 3 min.

Laver

1. Laver le canal avec de l'éthanol 70% pendant 2 min.
2. Laver le canal avec de l'éthanol à 100% pendant 2 min.

Eluer

1. Éluer l'ADN extrait dans de l'eau millipore pendant 3 min. Collectez 15 uL d'purifiée, PCR-prêts ADN.

* Le GuSCN du kit Qiagen (tampon RLT) a été utilisé.