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Summary

Nous décrivons un test fluorescent qui peut confirmer rapidement et à peu de frais la capacité de nouveaux composés à chélater le fer. Le test mesure la capacité des composés à surpasser l’activité de liaison au fer de la sonde fluorescente chélatrice du fer faible Calcein, ce qui entraîne une augmentation quantifiable de la fluorescence lors de la chélation.

Abstract

Les cellules cancéreuses ont besoin de grandes quantités de fer pour maintenir leur prolifération. Le métabolisme du fer est considéré comme une caractéristique du cancer, ce qui fait du fer une cible valable pour les approches anticancéreuses. La mise au point de nouveaux composés et l’identification de pistes pour d’autres modifications nécessitent la réalisation d’essais de preuve de mécanisme. Il existe de nombreux tests pour évaluer l’impact sur la prolifération ; Cependant, la capacité de chélater le fer est une mesure finale importante et parfois négligée en raison des coûts élevés de l’équipement et de la difficulté de quantifier rapidement et de manière reproductible la force de la chélation. Ici, nous décrivons une méthode de fluorescence acellulaire quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer. Notre test repose sur le colorant fluorescent peu coûteux Calcein, disponible dans le commerce, dont la fluorescence peut être quantifiée sur la plupart des lecteurs de plaques de microtitration fluorescentes. La calcéine est un chélateur de fer faible, et sa fluorescence est éteinte lorsqu’elle se lie à Fe^2+/3+ ; la fluorescence est restaurée lorsqu’un nouveau chélateur surpasse Calcein pour le Fe^2+/3+ lié. L’élimination de l’extinction fluorescente et l’augmentation de la fluorescence qui en résulte permettent de déterminer la capacité de chélation d’un nouveau chélateur putatif. Par conséquent, nous proposons un test peu coûteux et à haut débit qui permet le criblage rapide de nouveaux composés chélateurs candidats.

Introduction

Les changements phénotypiques des cellules qui sont liés au développement du cancer par le biais d’un ensemble commun de capacités biologiques modifiées sont maintenant communément appelés les caractéristiques du cancer. Parmi eux, on trouve des changements résultant de la reprogrammation du métabolisme énergétique, qui sont répandus en biologie des cellules cancéreuses¹. Une telle reprogrammation métabolique comprend un besoin accru de fer pour soutenir la prolifération rapide et la croissance tumorale². Cette soif de fer entraîne un dérèglement du métabolisme du fer, qui en soi est considéré comme une caractéristique du cancer ^3,4, avec une dérégulation survenant à tous les stades⁵. Les caractéristiques des métastases, plus récemment proposées par Welch et Hurst, incluent un rôle pour le fer⁶ puisque le fer peut induire un stress oxydatif, ce qui peut, à son tour, induire des modifications du génome, de l’épigénome et du protéome, augmentant ainsi la possibilité de métastases⁷. Des études épidémiologiques ont démontré un lien entre les niveaux de fer et l’augmentation de l’incidence du cancer⁸.

Étant donné que les cellules cancéreuses ont besoin de grandes quantités de fer, elles sont sensibles à la carence en fer et, par conséquent, à la chélation du fer. Nous avons récemment publié un article de synthèse soulignant le potentiel de la chélation du fer dans l’inversion de plusieurs caractéristiques du cancer par le biais de la perturbation des voies de signalisation oncogéniques^{NDRG1 9}. Cependant, l’utilisation de la chélation du fer comme traitement autonome du cancer n’a pas donné de résultats positifs dans les essais cliniques en raison de leur toxicité, de leur courte demi-vie, de leur métabolisme rapide et de leurs mécanismes de résistance émergents. Néanmoins, les chélateurs du fer se sont révélés prometteurs dans les études in vitro et in vivo , ce qui indique que des travaux supplémentaires sont nécessaires pour développer des chélateurs de fer efficaces pour le traitement du cancer. La chélation spécifique du fer est une stratégie validée dans la découverte de médicaments anticancéreux, mais seules quelques classes ont été rapportées à ce jour¹⁰.

L’identification et la caractérisation de nouveaux chélateurs du fer nécessitent la capacité de mesurer leur effet sur plusieurs paramètres. Bon nombre d’entre eux (tels que la prolifération, l’apoptose, la formation d’espèces réactives de l’oxygène) sont régulièrement mesurés et ont été décrits et examinés dans la littérature comme méthodes d’évaluation des caractéristiques du cancer¹¹. Lors de l’évaluation d’un nouveau chélateur du fer, de nombreux groupes examinent régulièrement l’effet sur les activités anti-prolifératives et redox ainsi que les effets sur l’afflux ou l’efflux de fer. Les techniques de prédiction in silico ¹² augmentent encore le nombre croissant de chélateurs du fer qui peuvent être dépistés.

Lacréation de chélateurs du fer nécessite la capacité de mesurer leur effet sur les niveaux de fer comme moyen de démontrer efficacement la preuve de principe. À l’heure actuelle, la méthode la plus courante pour ce faire est la cytométrie^{en flux 13} , qui est coûteuse, longue et peu quantifiable. Le choix du test est souvent basé sur la disponibilité de l’équipement expérimental, la vitesse et le coût d’un test. Par conséquent, la capacité de chélater le fer peut être une mesure finale négligée en raison des coûts élevés de l’équipement et de la difficulté de quantifier rapidement et de manière reproductible la force de la chélation. Ici, nous décrivons une méthode de fluorescence cellulaire sans cellule quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer.

Protocol

1. Préparation de la solution mère Lors de la préparation des solutions mères de Calcein, évitez la photodégradation en gardant les solutions dans l’obscurité. Préparez une solution de 1 mM de Calcein dans le PBS de Dulbecco, sans magnésium ni calcium14. Pour 5 ml de solution de 1 mM de Calcein, ajoutez 3,1 mg de Calcein (622,5 g/M) à 5 mL de PBS de Dulbecco. À l’aide de la chaussette de 1 mM de Calcein, préparer des aliq…

Representative Results

Pour la méthode présentée à l’étape 2, cette première expérience (Figure 1) a permis d’établir la gamme linéaire du lecteur de plaque de fluorescence de microtitration lors de la détection des émissions fluorescentes de Calcein. Nos résultats représentatifs montrent une large gamme linéaire de fluorescence de Calcein de 0 à 100 μM. L’ANOVA avec l’analyse post-hoc LSD démontre qu’il existe des différences statistiquement significat…

Discussion

La dépendance excessive des cancers au fer pour alimenter leur métabolisme fait de la chélation du fer un ajout potentiel aux régimes thérapeutiques⁴. Cependant, il est difficile de dépister rapidement les nouveaux chélateurs d’ions métalliques pour déterminer leur capacité à lier les ions fer. La sonde fluorescente Calcein, couramment utilisée et largement disponible, est connue pour agir comme un faible chélateur du fer et la liaison par les ions …

Materials

Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	215406	other wise known as FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	magnesium and calcium free
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Sigma-Aldrich	M0812	any optically transparent 96 well plate will work