Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren
Summary
Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Assay, der schnell und kostengünstig die Fähigkeit neuartiger Verbindungen bestätigen kann, Eisen zu chelatisieren. Der Assay misst die Fähigkeit von Verbindungen, die Eisenbindungsaktivität der schwachen Eisenchelat-Fluoreszenzsonde Calcein zu übertreffen, was zu einem quantifizierbaren Anstieg der Fluoreszenz führt, wenn eine Chelatbildung auftritt.
Abstract
Krebszellen benötigen große Mengen an Eisen, um ihre Proliferation aufrechtzuerhalten. Der Eisenstoffwechsel gilt als Kennzeichen von Krebs, was Eisen zu einem gültigen Ziel für Ansätze zur Krebsbekämpfung macht. Die Entwicklung neuartiger Verbindungen und die Identifizierung von Leitstrukturen für weitere Modifikationen erfordert die Durchführung von Assays zum Nachweis des Mechanismus. Es gibt viele Assays, um die Auswirkungen auf die Proliferation zu bewerten. Die Fähigkeit, Eisen zu chelatisieren, ist jedoch aufgrund der hohen Gerätekosten und der Herausforderung, die Stärke der Chelatbildung schnell und reproduzierbar zu quantifizieren, ein wichtiges und manchmal übersehenes Endpunktmaß. Hier beschreiben wir eine quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode, um die Fähigkeit neuartiger Verbindungen zu bestätigen, Eisen zu chelatisieren. Unser Assay basiert auf dem kommerziell erhältlichen, kostengünstigen Fluoreszenzfarbstoff Calcein, dessen Fluoreszenz auf den meisten fluoreszierenden Mikrotiterplatten-Readern quantifiziert werden kann. Calcein ist ein schwacher Eisenchelator, und seine Fluoreszenz wird gelöscht, wenn er Fe2+/3+ bindet; Die Fluoreszenz wird wiederhergestellt, wenn ein neuartiger Chelator Calcein um gebundenes Fe2+/3+ verdrängt. Durch die Entfernung des Fluoreszenz-Quenchings und die daraus resultierende Erhöhung der Fluoreszenz kann die Chelatfähigkeit eines neuartigen putativen Chelators bestimmt werden. Daher bieten wir einen kostengünstigen Hochdurchsatz-Assay an, der ein schnelles Screening neuartiger Chelatorkandidaten ermöglicht.
Introduction
Phänotypische Veränderungen an Zellen, die mit der Entwicklung von Krebs durch eine gemeinsame Reihe veränderter biologischer Fähigkeiten zusammenhängen, werden heute allgemein als Kennzeichen von Krebs bezeichnet. Darunter befinden sich Veränderungen durch die Umprogrammierung des Energiestoffwechsels, die in der Krebszellbiologie weit verbreitet sind1. Eine solche metabolische Reprogrammierung beinhaltet einen erhöhten Bedarf an Eisen, um eine schnelle Proliferation und ein schnelles Tumorwachstum zu unterstützen2. Dieser Eisendurst führt zu einem dysregulierten Eisenstoffwechsel, der an und für sich als Kennzeichen von Krebs gilt 3,4, wobei eine Fehlregulation in allen Stadien auftritt5. Zu den Kennzeichen der Metastasierung, die in jüngerer Zeit von Welch und vorgeschlagen wurden, gehört eine Rolle für Eisen6, da Eisen oxidativen Stress induzieren kann, was wiederum Veränderungen des Genoms, des Epigenoms und des Proteoms vermitteln kann, was die Möglichkeit einer Metastasierung erhöht7. Ein Zusammenhang zwischen dem Eisenspiegel und einem erhöhten Auftreten von Krebs wurde in epidemiologischen Studien nachgewiesen8.
Da Krebszellen große Mengen an Eisen benötigen, sind sie anfällig für Eisenmangel und damit für Eisenchelatbildung. Wir haben kürzlich einen Übersichtsartikel veröffentlicht, in dem wir das Potenzial der Eisenchelatbildung bei der Umkehrung mehrerer Kennzeichen von Krebs durch NDRG1 hervorheben, die die onkogenen Signalwege stören9. Die Verwendung von Eisenchelaten als eigenständige Krebstherapie hat jedoch in klinischen Studien aufgrund ihrer Toxizität, ihrer kurzen Halbwertszeit, ihres schnellen Stoffwechsels und ihrer aufkommenden Resistenzmechanismen keine positiven Ergebnisse gebracht. Nichtsdestotrotz haben sich Eisenchelatoren in In-vitro – und In-vivo-Untersuchungen als vielversprechend erwiesen, was darauf hindeutet, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um wirksame Eisenchelatoren für die Krebstherapie zu entwickeln. Die spezifische Eisenchelatbildung ist eine validierte Strategie in der Forschung von Krebsmedikamenten, aber bisher wurden nur über wenige Klassen berichtet10.
Die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger Eisenchelatoren erfordert die Fähigkeit, ihre Wirkung auf mehrere Endpunkte zu messen. Viele davon (wie Proliferation, Apoptose, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies) werden routinemäßig gemessen und wurden in der Literatur als Methoden zur Bewertung der Kennzeichen von Krebs beschrieben und überprüft11. Bei der Evaluierung eines neuartigen Eisenchelators untersuchen viele Gruppen routinemäßig die Wirkung auf antiproliferative und Redoxaktivitäten sowie die Auswirkungen auf den Eiseneinstrom oder -ausfluss. In-silico-Vorhersagetechniken 12 vergrößern den wachsenden Pool an Eisenchelatoren, die gescreent werden können, weiter.
DieHerstellung von Eisenchelatoren erfordert die Fähigkeit, ihre Wirkung auf den Eisenspiegel zu messen, um den Grundsatznachweis wirksam zu demonstrieren. Die derzeit gebräuchlichste Methode dafür ist die Durchflusszytometrie13 , die kostspielig, zeitaufwändig und schlecht quantifizierbar ist. Die Wahl des Assays hängt oft von der Verfügbarkeit der experimentellen Ausrüstung, der Geschwindigkeit und den Kosten eines Assays ab. Daher kann die Fähigkeit, Eisen zu chelatisieren, aufgrund der hohen Kosten für die Ausrüstung und der Herausforderung, die Stärke der Chelatbildung schnell und reproduzierbar zu quantifizieren, ein übersehenes Endpunktmaß sein. Hier beschreiben wir eine quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode, um die Fähigkeit neuartiger Verbindungen zu bestätigen, Eisen zu chelatisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die übermäßige Abhängigkeit von Krebserkrankungen von Eisen, um ihren Stoffwechsel anzukurbeln, macht die Eisenchelatbildung zu einer potenziellen Ergänzung zu therapeutischen Therapien4. Es gibt jedoch nur eine begrenzte Möglichkeit, neuartige Metallionenchelatoren schnell auf ihre Fähigkeit zur Bindung von Eisenionen zu untersuchen. Die häufig verwendete und weit verbreitete Fluoreszenzsonde Calcein ist dafür bekannt, dass sie als schwacher Eisenchelato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Northumbria University für ihre Unterstützung.
Materials
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 215406 | other wise known as FAS |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Deferiprone | Sigma-Aldrich | 379409 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | magnesium and calcium free |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | M0812 | any optically transparent 96 well plate will work |
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