新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法
Summary
ここでは、新規化合物が鉄をキレート化する能力を迅速かつ安価に確認できる蛍光アッセイについて説明します。このアッセイは、化合物が弱鉄キレート蛍光プローブCalceinの鉄結合活性を凌駕する能力を測定し、キレート化が起こると蛍光が定量化可能に増加します。
Abstract
がん細胞は、増殖を維持するために大量の鉄を必要とします。鉄代謝はがんの特徴と考えられており、鉄は抗がんアプローチの有効な標的となっています。新規化合物の開発とさらなる修飾のためのリードの同定には、メカニズムの証明アッセイを実施する必要があります。増殖への影響を評価するための多くのアッセイがあります。しかし、鉄をキレート化する能力は、機器のコストが高く、キレート化の強度を迅速かつ再現性よく定量化することが課題であるため、重要でありながら見過ごされがちなエンドポイント指標です。ここでは、新規化合物が鉄をキレート化する能力を確認するための、定量可能で安価な無細胞蛍光法について説明します。当社のアッセイは、市販の安価な蛍光色素であるカルセインに依存しており、その蛍光はほとんどの蛍光マイクロタイタープレートリーダーで定量化できます。カルセインは弱い鉄キレート剤であり、Fe2 + / 3 +に結合するとその蛍光は消光されます。蛍光は、新規のキレート剤が結合したFe2+/3+でカルセインを凌駕すると回復します。蛍光消光の除去とそれに伴う蛍光の増加により、新規推定キレート剤のキレート化能力を決定することができます。そのため、新規候補キレート化合物の迅速なスクリーニングを可能にする、安価でハイスループットなアッセイを提供しています。
Introduction
生物学的能力の変化という共通のセットを通じてがんの発生に関連する細胞の表現型の変化は、現在、一般的にがんの特徴と呼ばれています。その中には、エネルギー代謝の再プログラミングに起因する変化があり、これはがん細胞生物学1で広く見られます。このような代謝のリプログラミングには、急速な増殖と腫瘍の成長をサポートするための鉄の必要性の増加が含まれます2。この鉄への渇望は、鉄代謝の調節不全につながり、それ自体が癌の特徴と考えられており3,4、すべての段階で調節不全が起こります5。転移の特徴は、より最近ウェルチとハーストによって提唱され、鉄が酸化ストレスを誘発し、これがゲノム、エピゲノム、およびプロテオームの変化を媒介し、転移の可能性を高めることができるため、鉄6の役割が含まれる。鉄分濃度とがんの発生増加との関連は、疫学研究を通じて実証されています8。
がん細胞は大量の鉄を必要とするため、鉄欠乏症になりやすく、したがって鉄キレート化されやすくなります。私たちは最近、NDRG1が発がん性シグナル伝達経路9を阻害することにより、がんのいくつかの特徴を逆転させる鉄キレート化の可能性を強調する総説を発表しました。しかし、鉄キレート化を単独のがん治療として使用することは、その毒性、短い半減期、急速な代謝、および新たな耐性メカニズムのために、臨床試験で肯定的な結果をもたらしていません。それにもかかわらず、鉄キレート剤は in vitro および in vivo の研究で有望であることが示されており、がん治療に有効な鉄キレート剤を開発するにはさらなる研究が必要であることを示しています。特異的な鉄キレート化は、抗がん剤の創薬において検証された戦略ですが、これまでに報告されているクラスはごくわずかです10。
新規の鉄キレート剤の同定と特性評価には、いくつかのエンドポイントに対するその影響を測定する能力が必要です。これらの多くは(増殖、アポトーシス、活性酸素種形成など)日常的に測定されており、がんの特徴を評価する方法として文献で概説され、レビューされています11。新規の鉄キレート剤を評価する際、多くのグループは、鉄の流入または排出への影響だけでなく、抗増殖活性および酸化還元活性への影響も定期的に調査しています。 インシリコ 予測技術12 は、スクリーニング可能な鉄キレート剤の増大するプールをさらに増やす。
鉄キレート剤のクリーニングには、原理の証明を効果的に示す手段として、鉄レベルへの影響を測定する能力が必要です。現在、最も一般的な方法はフローサイトメトリー13ですが、これはコストと時間がかかり、定量化が困難です。アッセイの選択は、多くの場合、実験装置の利用可能性、速度、およびアッセイのコストに基づいています。したがって、鉄をキレート化する能力は、機器のコストが高く、キレート化の強度を迅速かつ再現性よく定量化することが課題であるため、見落とされるエンドポイントの尺度になる可能性があります。ここでは、新規化合物が鉄をキレート化する能力を確認するための、定量可能で安価な無細胞蛍光法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
がんが代謝を促進するために鉄に過度に依存しているため、鉄キレート化は治療体制に追加される可能性があります4。しかし、新規の金属イオンキレート剤が鉄イオンに結合する能力を迅速にスクリーニングする能力は限られています。一般的に使用され、広く入手可能な蛍光プローブCalceinは、弱い鉄キレート剤として作用し、鉄イオンによる結?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ノーサンブリア大学のご支援に感謝いたします。
Materials
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 215406 | other wise known as FAS |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Deferiprone | Sigma-Aldrich | 379409 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | magnesium and calcium free |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | M0812 | any optically transparent 96 well plate will work |
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