Количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо
Summary
Мы описываем флуоресцентный анализ, который может быстро и недорого подтвердить способность новых соединений хелатировать железо. В ходе анализа измеряется способность соединений вытеснять железосвязывающую активность слабого хелатирующего железа флуоресцентного зонда кальцеина, что приводит к количественно измеримому увеличению флуоресценции при хелировании.
Abstract
Раковым клеткам требуется большое количество железа для поддержания их пролиферации. Метаболизм железа считается отличительной чертой рака, что делает железо подходящей мишенью для противораковых подходов. Разработка новых соединений и идентификация отведений для дальнейшей модификации требует проведения тестов на доказательство механизма. Существует множество анализов для оценки воздействия на распространение; Тем не менее, способность хелатировать железо является важной и иногда упускаемой из виду конечной мерой из-за высокой стоимости оборудования и проблемы быстрой и воспроизводимой количественной оценки силы хелатирования. В этой статье мы описываем количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо. Наш анализ основан на коммерчески доступном недорогом флуоресцентном красителе кальцеин, флуоресценция которого может быть количественно определена на большинстве флуоресцентных микротитровальных планшетов. Кальцеин является слабым хелатором железа, и его флуоресценция гасится, когда он связывает Fe2+/3+; Флуоресценция восстанавливается, когда новый хелатор превосходит кальцеин по связанному Fe2+/3+. Устранение флуоресцентного гашения и, как следствие, увеличение флуоресценции позволяет определить хелатирующую способность нового предполагаемого хелатора. Поэтому мы предлагаем недорогой высокопроизводительный анализ, который позволяет проводить быстрый скрининг новых химических соединений-кандидатов.
Introduction
Фенотипические изменения в клетках, которые связаны с развитием рака через общий набор измененных биологических возможностей, в настоящее время обычно называют признаками рака. К их числу относятся изменения, возникающие в результате перепрограммирования энергетического обмена, которые широко распространены в биологии раковых клеток1. Такое метаболическое перепрограммирование включает в себя повышенную потребность в железе для поддержки быстрой пролиферации и роста опухоли2. Эта тяга к железу приводит к нарушению регуляции метаболизма железа, что само по себе считается признаком рака 3,4, причем нарушение регуляции происходит навсех стадиях5. Отличительные признаки метастазирования, недавно предложенные Уэлчем и Херстом, включают роль железа-6, поскольку железо может вызывать окислительный стресс, а это, в свою очередь, может опосредуть изменения в геноме, эпигеноме и протеоме, увеличивая возможность метастазирования. Связь между уровнем железа и увеличением заболеваемости раком была продемонстрирована в эпидемиологических исследованиях8.
Поскольку раковым клеткам требуется большое количество железа, они подвержены дефициту железа и, следовательно, хелатированию железа. Недавно мы опубликовали обзорную статью, в которой подчеркивается потенциал хелатирования железа в обращении вспять нескольких признаков рака посредством NDRG1, нарушающего онкогенные сигнальные пути9. Однако использование хелатирования железа в качестве самостоятельной терапии рака не дало положительных результатов в клинических испытаниях из-за его токсичности, короткого периода полувыведения, быстрого метаболизма и возникающих механизмов резистентности. Тем не менее, хелаторы железа показали многообещающие результаты в исследованиях in vitro и in vivo , что указывает на необходимость дополнительной работы по разработке эффективных хелаторов железа для терапии рака. Специфическое хелатирование железа является проверенной стратегией в разработке противоопухолевых препаратов, нона сегодняшний день сообщалось только о нескольких классах.
Идентификация и характеристика новых хелаторов железа требует возможности измерить их влияние на несколько конечных точек. Многие из них (такие как пролиферация, апоптоз, образование активных форм кислорода) регулярно измеряются и были описаны и рассмотрены в литературе в качестве методов оценкипризнаков рака. При оценке нового хелатора железа многие группы регулярно изучают влияние на антипролиферативную и окислительно-восстановительную активность, а также влияние на приток или отток железа. Методы прогнозирования in silico 12 еще больше увеличивают растущий пул хелаторов железа, которые могут быть экранированы.
Дляочистки хелаторов железа требуется возможность измерить их влияние на уровень железа в качестве средства эффективной демонстрации принципа. В настоящее время наиболее распространенным методом является проточная цитометрия13 , которая является дорогостоящей, трудоемкой и плохо поддается количественной оценке. Выбор анализа часто основывается на наличии экспериментального оборудования, скорости и стоимости анализа. Таким образом, способность хелатировать железо может быть упущена из виду из-за высокой стоимости оборудования и проблемы быстрой и воспроизводимой количественной оценки силы хелатирования. В этой статье мы описываем количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чрезмерная зависимость раковых опухолей от железа в качестве топлива для метаболизма делает хелатирование железа потенциальным дополнением к терапевтическим режимам4. Тем не менее, существует ограниченная возможность быстрого скрининга новых хелатор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Нортумбрийский университет за поддержку.
Materials
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 215406 | other wise known as FAS |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Deferiprone | Sigma-Aldrich | 379409 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | magnesium and calcium free |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | M0812 | any optically transparent 96 well plate will work |
References
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. Iron: An essential element of cancer metabolism. Cells. 9 (12), 2591 (2020).
- Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: More ore to be mined. Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
- Zhang, C., Zhang, F. Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).
- Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. Iron and cancer. Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).
- Welch, D. R., Hurst, D. R. Defining the hallmarks of metastasis. Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).
- Lehmann, U., et al. Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis. Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).
- Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. Iron and cancer risk–a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).
- Abdelaal, G., Veuger, S. Reversing oncogenic transformation with iron chelation. Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).
- Brown, R. A. M., et al. Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology. Front Oncol. 10, 476 (2020).
- Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).
- Basu, A., et al. Discovering novel and diverse iron-chelators in silico. J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).
- Prus, E., Fibach, E. Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells. Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).
- Cold Spring Harb. . Phosphate-buffered saline (pbs). 2006 (1), (2006).
- Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects. Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).
